타액선 조직에서 살리스피어 배양: 인간 타액선 유래 상피 세포에서 살리스피어를 개발하는 방법

타액구는 타액선에서 파생된 상피 세포의 시험관 내 자가 응집 배양입니다. 타액구를 배양하려면 먼저 인간 침샘 조직을 배양 플레이트에 넣으십시오.

위를 사용하여 조직을 잘게 썬다. 다음으로, 콜라게나제 및 분산 효소를 함유한 해리 용액으로 이 조각을 보충하고 배양합니다. 이 효소는 조직에 존재하는 세포외 기질을 소화합니다.

또한 조직을 균질화하기 위해 분쇄합니다. 이 단계는 상피 세포와 적혈구를 용액으로 방출합니다. 다음으로, 세포 여과기를 사용하고 조직 균질을 새로운 원추형 튜브로 여과하여 소화되지 않은 조직 조각과 잔해물을 제거합니다. 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

원심분리 후, 상청액을 버리고 세포 펠릿을 RBC 용해 완충액에 재현탁합니다. 이 완충액은 세포 현탁액에 존재하는 적혈구를 파열시킵니다.

이제 원심분리하여 상피 세포를 펠릿화합니다. 펠릿을 적절한 상피 세포 성장 배지에 재현탁합니다. 또한 액화 기저막 매트릭스 또는 BMM으로 웰을 코팅하여 타액 배양 플레이트를 준비합니다. 매트릭스가 응고될 수 있도록 배양합니다.

마지막으로, 상피 세포 현탁액을 BMM 코팅 웰에 첨가합니다. 성장 배지가 있는 경우 상피 세포는 BMM 층에 부착되어 구형 타액 구로 증식합니다.

환자로부터 제거한 후 2-4시간 이내에 배양 플레이트에서 오토 클레이브 멸균 해부 가위와 수술용 겸자를 사용하여 침샘 조직을 1-2mm 크기의 미세한 조각으로 다집니다. 다진 조직에 6밀리리터의 디스파아제/콜라게나제 용액을 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 약 30분에서 1시간 동안 배양합니다.

5밀리리터 혈청학적 피펫으로 15-20회 피펫팅하여 조직을 파괴합니다. 섭씨 37도에서 30분에서 1시간 더 배양합니다. 피펫팅 및 배양 단계를 2-3회 더 반복하거나 조직이 슬러리와 유사하고 피펫 개구부를 쉽게 통과할 수 있을 때까지

BMM으로 웰을 코팅하려면 하룻밤 해동된 BMM 500마이크로리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 천천히 피펫팅합니다. 플레이트를 천천히 소용돌이쳐 BMM을 웰 전체에 고르게 분포시킵니다. 그런 다음 코팅된 플레이트를 사용하기 전에 섭씨 37도에서 최소 15분 동안 배양하여 BMM이 응고되도록 합니다.

균질화된 조직을 포함하는 디스파아제/콜라게나제 용액을 15mm 원추형 튜브로 옮깁니다. 6밀리리터의 DPBS로 플레이트 벽을 한 번 세척하여 나머지 세포를 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 70마이크로미터 나일론 메쉬 세포 스트레이너를 통해 균질을 새로운 50mm 원추형 튜브로 여과하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다.

변형된 세포를 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 10밀리리터의 1x RBC 용해 완충액에 재현탁합니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 20-25mm의 DPBS를 첨가하여 RBC 용해 완충액을 중화하고 타액 세포의 용해를 최소화합니다.

500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 백혈구 펠릿은 모든 적혈구의 완전한 용해를 나타냅니다. 펠릿이 빨간색이면 RBC 용해 완충액으로 처리를 반복합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿을 1-2밀리리터의 BEGM에 재현탁한 다음 재현탁된 세포를 BMM 코팅 웰로 옮깁니다.

섭씨 37도에서 배양합니다. BMM에 도금되면 세포는 2-3일 동안 구형 구조 또는 타액 구형으로 형성됩니다. 세포는 BMM이 분해되기 시작하기 전에 약 5-7일 동안 타액 구로 유지될 수 있으며, 이를 통해 세포는 플라스틱에 접근하여 부착되어 단층으로 성장할 수 있습니다.