세포외 DNA 염색: FFPE 조직 절편에서 세포외 DNA를 식별하는 방법

죽어가는 세포는 세포외 DNA라고 하는 세포 외부의 DNA 일부를 방출합니다. 세포외 DNA를 염색하려면 먼저 유리 슬라이드에 포르말린 고정 파라핀 포매 또는 FFPE 조직 절편을 채취합니다. 원하는 시간 동안 유리 슬라이드를 가열합니다. 이것은 슬라이드 표면에 조직의 부착을 용이하게 하고 주변 파라핀을 부드럽게 합니다.

슬라이드를 탈파라핀화액에 담그면 조직 주변의 파라핀층이 완전히 용해됩니다. 다음으로, 슬라이드를 감소하는 농도의 에탄올에 담그고 탈파라핀화된 조직을 재수화합니다. 재수화 후 슬라이드를 끓는 항원 회수 용액에 담그십시오. 이 처리는 고정 과정에서 변경된 에피토프를 밝힙니다.

슬라이드에 1차 항체를 오버레이하고 세포에 존재하는 특정 마스킹되지 않은 에피토프에 결합하도록 합니다. 그런 다음 1차 항체에 결합하는 형광 태그가 부착된 2차 항체를 추가합니다. 슬라이드를 Sudan Black 용액에 담가 배경 자가형광을 줄입니다.

마지막으로 DAPI가 보충된 마운팅 매체 한 방울을 조직 절편 위에 놓고 커버슬립으로 밀봉합니다. DAPI 분자가 DNA를 염색할 수 있도록 배양합니다. 형광 현미경을 사용하여 준비된 조직 절편을 시각화합니다. 세포의 형광 표지 에피토프는 세포 내부에 존재하는 핵 DNA를 세포외 DNA와 구별하는 데 도움이 됩니다.

세포외 DNA 염색의 경우, 먼저 슬라이드 랙에서 관심 있는 샘플을 섭씨 60도에서 60분 동안 가열한 후 슬라이드를 흄 후드에 40분 동안 두 번 교체하는 용매에 담급니다. 두 번째 침지 후, 샘플을 100% 에탄올에 두 번, 70% 에탄올에 한 번 처리당 5분 동안 재수화합니다.

마지막 치료 후 집게를 사용하여 슬라이드를 끓는 항원 회수 용액에 넣고 압력솥에 10분 동안 가열합니다. 항원 에피토프의 마스킹을 해제한 후 압력솥을 열에서 싱크대로 옮기고 즉시 뚜껑 위에 차가운 수돗물을 흘립니다.

슬라이드가 항원 회수 용액에서 20분 동안 평형을 유지한 후 샘플을 오비탈 셰이커에서 0.01몰 PBS로 세척당 5분 동안 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 소수성 펜을 사용하여 신장 조직 샘플 주위에 원을 그리고 실온에서 30분 동안 5% 소 혈청 알부민에 60마이크로리터의 10% 닭고기 혈청으로 비특이적 염색을 차단합니다.

배양이 끝나면 차단 용액을 섭씨 4도의 습도 챔버에서 밤새 관심 1차 항체 60마이크로리터로 조심스럽게 교체합니다. 다음날 아침, 실온에서 40분 동안 배양하기 위해 각 슬라이드에 60마이크로리터의 적절한 형광단 접합 2차 항체를 추가하기 전에 PBS의 오비탈 셰이커에서 슬라이드를 세척당 2분 동안 세척합니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 PBS에서 슬라이드를 세척한 다음 70% 에탄올에 0.3% 수단 흑색으로 처리하여 잠재적인 포르말린 유도 자가형광을 소멸시킵니다. 30분 후 슬라이드를 수돗물로 세척하여 침전물을 제거하고 슬라이드를 PBS에 10분 동안 담가 더 이상 수단 블랙 침전물이 형성되지 않도록 합니다.

배양이 끝나면 DAPI가 보충된 360마이크로리터의 마운팅 용액 방울로 슬라이드를 공초점 유리 커버슬립에 장착하고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. 슬라이드를 실온에서 24시간 동안 경화시킵니다. 표준 프로토콜에 따라 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 이미징할 때까지 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 보관하십시오.