0 조회수 • 2:42 분 • April 30th, 2023
암 스페로이드는 종양 세포의 3차원 세포 응집체입니다. 이러한 스페로이드는 콜라겐 매트릭스에 내장되어 스페로이드 블록을 형성할 수 있습니다. 스페로이드 블록을 급속 냉동하려면 먼저 콜라겐 젤 스페로이드 블록을 조직학 몰드의 중앙에 놓습니다.
적절한 완충액으로 블록을 헹구고 금형에 고정 용액을 보충하십시오. 이 용액이 스페로이드에 침투하고 세포 단백질에 가교되도록 배양합니다. 이 단계는 후속 절차를 위해 스페로이드 구조를 유지하는 데 도움이 됩니다. 다음으로 고정액을 흡인합니다.
스페로이드 겔 블록을 포매 배지의 얇은 층이 포함된 새로운 조직학 몰드에 넣습니다. 스페로이드 블록을 완전히 잠기도록 더 많은 매립 매체로 오버레이합니다. 마지막으로 금형을 액체 질소 수조에 짧은 시간 동안 담그십시오.
급속 동결은 스페로이드 내에서 더 큰 얼음 결정이 형성되는 것을 방지합니다. 기계적 손상을 일으키지 않고 스페로이드 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 포베딩 매체 층이 스페로이드 블록 주위에 응고되면 금형에서 냉동 블록을 제거합니다. 추가 조직학적 분석을 위해 냉동 스페로이드 블록을 저온에 보관하십시오.
먼저 작은 집게를 사용하여 챔버 슬라이드에서 콜라겐 젤과 스페로이드 블록을 들어 올립니다. 그런 다음 콜라겐 젤 블록을 플라스틱 조직학 금형에 넣습니다. 콜라겐 겔 블록을 1X PBS로 잠시 헹구고 실온에서 30분 동안 PBS에 4% PFA로 고정합니다. 그런 다음 콜라겐 젤 블록을 1X PBS 1.5밀리리터로 셰이커에서 15분 동안 세척합니다.
새로운 플라스틱 조직학 금형의 바닥에 OCT 화합물의 얇은 층을 도포합니다. 그런 다음 고정 및 세척된 콜라겐 젤 블록을 OCT 화합물 위에 놓고 몰드의 나머지 부분을 OCT 화합물로 조심스럽게 채웁니다. 금형을 섭씨 4도에서 1시간 동안 유지합니다. 그런 다음 액체 질소 위에 떠 있는 100mm 페트리 접시에 금형을 급속 냉동하고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.