마우스 방광의 요로텔륨으로 DNA 플라스미드 전달: 유전자 조작 모델을 생성하기 위해 DNA 플라스미드를 쥐 방광의 요로텔륨 세포로 효율적으로 전달하기 위한 전기천공 기반 절차

시작하려면 마취된 암컷 마우스를 바로 누운 자세로 준비합니다. 방광이 완전히 비어 있는지 확인하십시오. 요도 입구를 통해 윤활 카테터를 삽입합니다. 윤활은 방광으로 들어가기 위한 원활한 요도 통로를 돕습니다.

카테터 삽입 후 복부 절개를 하고 내부 근육 조직을 해부하여 방광을 노출시킵니다. 다음으로, 적절한 염료와 혼합된 DNA 플라스미드 현탁액을 카테터의 바깥쪽 끝에 피펫팅합니다. 이 DNA 플라스미드는 형광 리포터 유전자를 암호화합니다.

주사기를 카테터에 부착하고 밀어 플라스미드 용액을 방광으로 전달합니다. 주입된 염료 분자는 방광을 착색하여 플라스미드 용액의 성공적인 투여를 확인합니다. 카테터 어셈블리를 제거하고 외부 요도 구멍을 조여 플라스미드 용액이 유출되는 것을 방지합니다.

이제 전기천공 발생기에 연결된 두 개의 전극을 사용하여 방광을 꼬집습니다. 원하는 기간 동안 적절한 전압의 전기 펄스를 방광에 적용합니다. 방광의 가장 안쪽 내벽인 방광 요로상피가 적용된 전기장에 노출되면 요로상피 세포막에 일시적인 기공이 생깁니다.

증가된 막 투과성은 주입된 DNA 플라스미드를 세포로 효율적으로 전달할 수 있게 합니다. 전기천공 후 수술 절개 부위를 봉합합니다. 마우스가 복구되도록 합니다. DNA 플라스미드로 형질감염된 요로상피 세포는 형광 리포터 단백질을 발현합니다.

형질감염할 각 방광에 대해 마이크로리터당 1마이크로그램으로 최소 20마이크로리터의 DNA 플라스미드를 준비합니다. 다음으로, 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 20마이크로리터의 플라스미드 용액에 1마이크로리터의 트리판 블루를 넣고 피펫으로 잘 섞습니다. 플라스미드를 전달하려면 복부에 70% 에탄올을 바르십시오. 방광 위의 복부 피부를 열려면 1cm의 수직 절개

를 합니다.

다음으로 근육층을 잘라 방광을 노출시킵니다. 최소 20마이크로리터의 플라스미드와 트리판 블루 용액을 카테터 바깥쪽 끝에 피펫팅하고 주사기에 부착합니다. 그런 다음 플라스미드 용액을 방광에 주입합니다. 방광이 파란색으로 변하면 주사가 성공한 것입니다. 방광에 기포가 생기지 않도록 카테터에 약간의 액체를 남겨 두십시오.

그런 다음 외부 요도 구멍을 잡고 카테터와 주사기를 제거합니다. 끈을 사용하여 외부 요도 구멍을 조입니다. 끈으로 두 개의 고리를 만든 다음 두 개의 매듭으로 묶습니다. 이는 두 사람이 협력해야 하는 중요한 단계입니다. 플라스미드가 새지 않도록 매듭이 단단히 조

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