제브라피시 배아에 네프로톡신의 정맥 미량 주입: 제브라피시 배아의 혈류로 신독성 물질을 전달하는 기술

정맥 미세 주사는 관심 분자를 수용 동물의 혈류로 전달하는 것을 용이하게 합니다. 제브라피쉬 배아에 네프로톡신을 전달하려면 먼저 원하는 네프로톡신 용액의 적절한 농도를 준비합니다.

미세한 젤 로딩 팁을 사용하여 이 네프로톡신 용액을 날카로운 각진 팁이 있는 미세 주입 바늘에 로드합니다. 바늘을 수직으로 매달아 네프로톡신 용액이 중력에 의해 바늘 끝을 채울 수 있도록 합니다. 이제 로드된 미세 주입 바늘을 마이크로 매니퓰레이터의 홀더에 고정합니다.

그런 다음 마취된 제브라피쉬 배아를 조립식 미세 사출 금형으로 옮깁니다. 금형의 배아를 머리가 우물 안으로 향하고 꼬리가 우물 밖으로 향하도록 정렬하여 미세 주입을 위한 꼬리에 대한 접근성을 향상시킵니다. 다음으로 바늘 끝을 배아 근처에 정확하게 배치합니다.

네프로톡신 용액을 배아의 꼬리 정맥에 주입합니다. 주입된 신독성 물질은 순환계를 통해 퍼져 신장과 같은 먼 장기에 도달합니다. 바늘을 부드럽게 집어넣습니다. 배아를 배아 배지가 들어 있는 신선한 접시에 옮기고 회복되도록 합니다. 특정 기간 동안 배아를 배양합니다.

주사 후 몇 시간 이내에 신옥소가 신장에 축적되어 손상을 일으켜 신장 기능이 저하됩니다.

주사 당일, 적절한 비히클 대조군으로 원하는 네프로톡신 용액을 준비합니다. 소용돌이치거나 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 튜브의 측면과 물기둥의 상단을 확인하여 약물이 용액에 용해되었는지 확인하십시오.

미세한 젤 로딩 팁을 바늘 뒷면에 끼워 2-3마이크로리터의 네프로톡신을 트리밍된 미세주사 바늘에 로드하고 테이프로 바늘을 수직으로 매달아 용액이 중력에 의해 트리밍된 바늘 팁을 채울 수 있도록 합니다.

바늘 끝이 가득 차면 로드된 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다. 마이크로미터 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 놓고 오일에 주입하여 미세 주입량을 테스트하여 액적 크기를 평가합니다.

다음으로, 인큐베이터에서 배아 접시를 꺼내 배아 접시에 0.2% 트리케인 5밀리리터를 첨가하여 마취합니다. 그런 다음 이송 피펫을 사용하여 배아를 사출 금형으로 옮깁니다. 각 배아를 틀의 다른 우물로 조종하여 몸통이 움푹 들어간 곳을 따라 놓이고 꼬리가 튀어나오도록 우물의 가장 깊은 영역에 머리를 놓습니다.

이제 채워진 바늘을 마이크로매니퓰레이터에 삽입하고 바늘 끝을 배아 옆에 놓습니다. 미세 주입을 위해 바늘을 꼬리 정맥에 부드럽게 삽입합니다.

절차의 가장 중요한 단계는 미세 주입입니다. 성공을 보장하려면 바늘을 날카로운 각도로 절단하고 배아 옆 위치로 조심스럽게 이동해야 합니다.

주입에 성공하면 액체가 순환계로 들어가는 것을 볼 수 있습니다. 신독성제와 형광 접합 덱스트란을 병용 주사하면 연구원은 시술 후 성공적인 주사를 확인할 수 있습니다. 그런 다음 배아에서 바늘을 부드럽게 제거합니다.

배아를 깨끗한 접시에 옮기고 헹구어 신선한 E3/PTU로 트리카인을 제거합니다. 그런 다음 배아를 원하는 시점으로 배양하여 형태를 평가하며, 이는 메틸셀룰로오스 마운팅 배지의 사진 또는 원하는 실험 분석 프로세스로 문서화할 수 있습니다.

신장 손상을 나타내는 부종이 있는 개인의 비율을 결정하기 위해 주사 후 12-24시간마다 배아의 회복을 평가해야 합니다.