미세아교세포작용 분석법: iPSC 대식세포를 사용하여 신경모세포종 세포에 대한 미세아교세포작용 모델을 확립하기 위한 체외 분석

미세아교세포는 식균작용이라는 과정을 통해 병원균, 세포 파편, 암성 신경세포 또는 신경모세포종을 제거하는 데 도움이 되는 뇌 대식세포입니다.

시험관 내에서 식균작용을 모방하려면 파라포름알데히드에 고정된 신경모세포종 세포의 배양으로 시작합니다.

화학적 고정제인 파라포름알데히드는 포스파티딜세린과 같은 막 인지질의 무작위 분포를 유발하여 세포막의 외부 표면으로 이동시키는 동시에 세포 구조를 안정화시킵니다.

이제 pH에 민감한 아민 반응성 형광 염료를 신경모세포종 세포 배양에 첨가하고 배양합니다.

염료 분자는 신경모세포종 세포 표면의 포스파티딜세린의 아민기에 결합합니다.

튜브를 원심분리하고 결합되지 않은 염료 분자를 포함하는 상청액을 제거합니다. 적절한 완충액과 원심분리기로 세포 펠릿을 헹굽니다.

상청액을 제거하고 펠릿을 배양 배지에 재현탁합니다.

다음으로, 배양 플레이트에 미리 염색된 대식세포를 시드합니다. 염색된 대식세포는 파란색 핵과 함께 빨간색으로 나타납니다.

염

색된 신경모세포종 세포를 이 배양액에 추가하고 배양합니다.

대식세포-식세포 수용체는 신경모세포종 세포에 노출된 포스파티딜세린을 인식하고 이를 식세포라고 하는 막 구획에서 내재화합니다.

식세포는 이동하고 리소좀과 융합하여 신경모세포종 세포를 리소좀의 낮은 pH 환경에 노출시킵니다. 낮은 pH는 신경모세포종 세포의 염료 분자를 활성화하여 염료 색상을 변화시킵니다.

형광 현미경에서 식균된 신경모세포종 세포는 적색 대식세포 내부에서 노란색으로 나타납니다.

SH-SY5Y를 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다. 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포를 2밀리리터의 페놀 적색이 없는 HEPES 완충 배지에 재현탁하여 고정하기 전에 덩어리를 분해합니다.

튜브에 4% 파라포름알데히드 2밀리리터를 첨가하고 가끔 부드럽게 교반하면서 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 고정합니다. 튜브에 HBSS 10밀리리터를 추가합니다.

그런 다음 1,200 x g에서 7분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 2밀리리터의 페놀 적색이 없는 HEPES 완충 배지에 재현탁합니다. 100만 개의 SH-SY5Y 세포를 계수하고 2밀리리터 저단백 결합 튜브로 제거합니다.

페놀 레드가 없는 HEPES 완충 배지를 사용하여 총 부피를 300 내지 500 마이크로리터로 만듭니다. 그런 다음 섭씨 37도의 수조에서 튜브를 잠시 데웁니다. 제조업