신선 냉동 신경교종 조직에서 핵 분리: 신경교종 종양 샘플에서 온전한 핵을 얻는 방법

핵을 분리하려면 먼저 페트리 접시에서 신선한 냉동 신경아교종 샘플(뇌의 신경교세포에서 발생하는 종양)을 채취합니다.

조직 분해를 방지하기 위해 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다.

다음으로 조직 샘플을 작은 조각으로 다집니다.

다진 조직 조각에 미리 냉각된 용해 완충액을 추가합니다. 혼합물을 Dounce 균질화기로 옮깁니다. 유봉을 사용하여 조직을 균질화하여 세포를 분해하고 용해를 시작합니다.

이제 균질을 신선한 용해 완충액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 균질을 기계적으로 파괴합니다. 이 단계는 세포에서 세포질 소기관의 방출을 촉진합니다.

그런 다음 적절한 크기의 세포 스트레이너를 사용하여 균질액을 새 튜브로 여과하여 조직 파편 및 기타 오염 물질을 제거합니다.

여과 후 다양한 세포 소기관이 포함된 여과액을 섭취하십시오.

여과액을 저속으로 원심분리하여 바닥에 있는 밀도가 높은 핵을 펠릿화하고 다른 세포 소기관은 상청액에 남아 있습니다.

소기관 함유 상청액을 버립니다. 추가 다운스트림 시퀀싱을 위해 조핵이 풍부한 펠릿을 적절한 저장 완충액에 보관합니다.

먼저 10-60mg의 신선한 냉동 조직 샘플을 미리 냉장된 페트리 접시로 옮깁니다. 신선한 냉동 티슈를 면도날로 얼음 위에 작은 조각으로 다지거나 자릅니다. 500마이크로리터의 냉각된 핵 용해 완충액을 페트리 접시의 조직에 추가합니다.

그런 다음 혼합물을 Douncer로 옮깁니다. 마찰이 줄어들 때까지 "느슨한" 유봉으로 티슈 조각을 약 20회 두드리십시오. 그런 다음 '단단한' 유봉으로 20회 두르면 완전한 조직 균질화가 가능합니다.

균질을 미리 냉각된 2밀리리터 튜브로 옮기고 냉각된 용해 완충액 1밀리리터를 Douncer에 넣고 헹구고 튜브에 추가합니다. 부드럽게 섞고 얼음 위에서 5분 동안 배양하고, 배양하는 동안 와이드 보어 피펫 팁으로 1-2회 혼합합니다.

30마이크로미터 스트레이너 메쉬를 사용하여 전체 균질수를 걸러내고 15밀리리터 Falcon 튜브에 모으십시오. 그런 다음 미리 냉각된 새 2밀리리터 튜브에 다시 옮깁니다. 일반적으로 단일 스트레이너는 전체 균질수에 충분합니다.

광학 현미경으로 샘플을 확인하여 큰 파편의 제거와 핵막의 온전함을 확인합니다. 핵은 둥글 필요가 없으며 핵막이 왜곡되어서는 안 됩니다. 파편이 있으면 여과를 반복하십시오.

다음으로, 탁상용 원심분리기에서 핵을 5분 동안 원심분리합니다