Gradient Centrifugation Based Purification of Nuclei: A technique to obtain extrapure fraction of intact nuclei using Density gradient centriugation(구배 원심분리 기반 핵 정제: 밀도 구배 원심분리를 사용하여 온전한 핵의 초순수 분획을 얻는 기술)

온전한 핵을 분리하고 정제하려면 먼저 튜브에 조핵 분획을 채취하십시오. 분획에는 깨진 핵 조각 및 파편과 함께 온전한 핵이 포함되어 있습니다.

이 분획을 적절한 밀도 구배 매질과 혼합하여 가장 낮은 농도의 현탁액을 형성합니다.

이제 미리 준비된 조핵 분획 아래에 동일한 구배 매질의 밀도가 증가하는 용액을 층층하여 다단계 불연속 밀도 구배를 생성합니다. 이 단계를 통해 조핵 분획이 구배의 상단에 밴드를 형성할 수 있습니다.

다음으로 튜브를 저속으로 원심분리합니다.

모양과 질량의 차이에 따라 온전한 핵은 파편 및 핵 파편에 비해 다르게 이동합니다. 그 결과 온전한 핵이 별도의 밴드를 형성합니다.

원심분리 후, 밀도 구배 용액의 계면에서 온전한 핵으로 구성된 별개의 밴드를 찾습니다.

피펫을 사용하여 그라디언트의 최상층을 흡인하여 순수한 핵 밴드에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 핵 함유 밴드를 새 튜브에 모으십시오.

광학 현미경으로 이 핵을 시각화하십시오. 온전한 핵은 온전한 핵막이 둘러싸고 완벽하게 둥글게 보입니다.

마지막으로 추가 분석을 위해 순수 핵 분획을 보관합니다.

25% 요오딕산올의 최종 농도를 위해 핵에 200마이크로리터의 50% 요오딕산올 용액을 첨가하고 300마이크로리터로 설정된 피펫으로 10회 혼합합니다.

그런 다음 층이 혼합되지 않도록 P1000 미세한 팁을 사용하여 25% 혼합물 아래에 300마이크로리터의 29% 요오딕산올 용액을 추가합니다. P300 미세한 팁이 있는 29% 혼합물 아래에 300마이크로리터의 35% 요오딕사놀 용액을 추가합니다. 그런 다음 천천히 제거하십시오.

샘플을 스윙 버킷 원심분리기에 넣고 브레이크를 끈 상태에서 섭씨 4도에서 3,500 x g에서 20분 동안 회전시킵니다.

흔들지 않고 샘플을 부드럽게 제거하고 빛 아래에서 관찰하십시오. 순도 95%의 핵의 투명한 흰색 띠가 두 번째와 세 번째 층 사이에 보여야 합니다.

핵을 분리하려면 최상층을 흡인하여 계면에 흰색 핵 밴드를 노출시킵니다. 핵 밴드를 200밀리리터 부피로 수집하여 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 20마이크로미터 필터로 걸러냅니다.

광학 현미경으로 핵을 확인하여 큰 파편의 제거와 핵막의 온전함을 확인하십시오. 둥글어야 하며 핵막이 뒤틀리지 않아야 합니다.