유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

0 조회수4:00 • April 30th, 2023

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단백질의 유비퀴틴화는 기질 단백질의 라이신 잔기에 디글리신 잔기를 통해 조절 미니 단백질인 유비퀴틴을 첨가하는 것을 특징으로 합니다. 이것은 기질 단백질과 유비퀴틴 사이에 라이신-글리신-글리신 결합을 생성합니다.

유비퀴틴 태그가 있는 펩타이드를 분리하려면 먼저 펩타이드 믹스를 섭취하십시오.

이 펩타이드를 엔도뉴클레아제 효소 칵테일로 처리하십시오. 처리하는 동안 효소 Lys-C와 트립신은 아르기닌 잔기에서 유비퀴티닐화된 펩타이드를 효율적으로 절단하여 시그니처 디글리신 모티프를 포함하는 펩타이드 단편을 생성합니다.

이러한 펩타이드 단편을 항체 접합 하이드로겔 비드의 슬러리에 첨가합니다.

이 항체는 유비퀴티닐화된 펩타이드에만 독점적으로 결합하여 펩타이드-비드 복합체를 형성하는 디글리신 인식 부위를 포함합니다.

유비퀴티닐화된 펩타이드-비드 복합체를 펠릿화하기 위한 원심분리기. 결합되지 않은 비유비퀴티닐화 펩타이드 함유 상청액을 제거합니다.

콤플렉스를 필터 조립품에 로드합니다. 원심분리하여 완충액을 제거하고 펩타이드 접합 비드를 포획합니다.

pH를 낮추는 산성화 시약을 첨가하여 비드에서 펩타이드가 분리

되도록 합니다.

여과액에서 유리 펩타이드를 회수합니다. 소수성 매트릭스가 있는 새 필터에 로드합니다. 펩타이드는 매트릭스에 남아 산성 염은 씻겨 나가는 동안 머물

러집니다.

적절한 용매를 사용하여 펩타이드를 분리합니다.

유비퀴티닐화된 펩타이드를 새 튜브로 옮기고 건조시켜 미량의 용매를 제거합니다.

단백질 A 아가로스 비드 슬러리에 접합된 유비퀴틴 잔여 모티프 항체의 한 배치를 6개의 동일한 분획으로 분할합니다. 원고 지시에 따라 세 가지 펩타이드 분획을 용해시키고 파편을 회전시킵니다.

3개 분획의 상청액을 비드 슬러리에 첨가하고 나머지 3개 분획은 얼음 위에 보관하고 회전 장치에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 구슬을 회전시킵니다. 상청액을 새로운 비드 배치로 옮기고 나머지 3개의 비드 슬러리 분획으로 배양을 반복합니다.

후속 글로벌 프로테옴 분석을 위해 상청액을 저장하고 비드를 GF/F 필터 플러그가 장착된 200마이크로리터 피펫 팁으로 옮깁니다.

원심분리기 팁 어댑터가 장착된 1.5밀리리터 튜브에 팁을 넣고 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 IAP 완충액으로 비드를 세 번 세척한 다음 얼음처럼 차가운 정제수로 세 번 세척합니다.

세척 사이에 2분 동안 컬럼을 200 x g으로 회전시키면서 컬럼이 마르지 않도록 합니다. 최종 세척 후, 0.15% TFA의 50마이크로리터를 2회 사이클로 펩타이드를 용리합니다. C18 스테이지 팁으로 펩타이드를 탈염하고 진공 원심분리로 건조시킵니다.

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