JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 3:37 분 • April 30th, 2023
미세아교세포는 더 큰 세포사멸체와 더 작은 미세 크기의 소포를 포함하여 세포외 소포 또는 EV 형태의 면역 매개체를 시험관 내에서 성장 배지로 방출합니다.
EV를 분리하려면 먼저 미세아교세포 조절 배지를 복용하십시오. 이 배양 배지에는 방출된 EV와 함께 미세아교세포가 포함되어 있습니다. 배지를 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
EV, 파편 및 단백질 응집체를 포함하는 상청액을 새 튜브에 수집합니다. 세포 파편과 큰 세포사멸체를 제거하기 위해 다시 원심분리합니다.
상청액을 초원심분리기 튜브로 옮깁니다. 고속으로 원심분리합니다.
사용한 배지를 포함하는 상청액을 버리고 EV 및 단백질 응집체 펠릿을 원하는 완충액에 재현탁합니다.
동시에베이스에 적절한 필터가 있는 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용합니다.
정의된 기공 크기의 다공성 체를 형성하는 구형 젤 비드로 구성된 겔 여과 매트릭스로 컬럼을 단단히 포장합니다.
고정상 위에 EV 및 단백질 응집체 현탁
액을 로드합니다.현탁액이 컬럼을 통과함에 따라 더 큰 크기의 EV는 젤 비드 사이의 입자 간 공간을 통해 이동하여 더 짧은 경로를 이동합니다. 대조적으로, 더 작은 크기의 단백질 응집체는 더 긴 경로를 따라 모공으로 이동합니다.
결과적으로 EV는 컬럼에서 먼저 용리됩니다.
EV가 포함된 분획을 수집하여 추가 분석에 사용합니다.
미세아교세포 또는 대식세포 배양액에서 컨디셔닝된 배양 배지를 원추형 튜브로 옮기고 1,200 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 새 원추형 튜브로 옮기고 20분 더 원심분리하여 세포사멸체를 제거합니다.
그런 다음 상층액을 10.4밀리리터 폴리카보네이트 튜브로 옮깁니다. 튜브를 70.1Ti 로터에 넣고 섭씨 4도에서 90분 동안 100,000 x g으로 초원심분리하여 EV를 펠릿화합니다. 원심분리 후, 상청액을 버리고 펠릿을 200마이크로리터의 0.2마이크로미터 여과된 PBS에 재현탁합니다.
EV를 분리하려면 유리 크로마토그래피 컬럼을 세척 및 멸균하고 바닥에 60마이크로미터 필터를 배치하여 집에서 만든 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 준비합니다. 가교 아가로스 겔 여과 베이스 매트릭스와 컬럼을 쌓아 직경 0.6cm, 높이 20cm의 고정상을 만듭니다.
그런 다음 50밀리리터의 0.2마이크로미터 여과된 PBS로 상을 헹굽니다. 필요한 경우 나중에 사용할 수 있도록 컬럼을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 재현탁된 EV 펠릿을 고정상 위에 놓고 고정상 상단에 PBS를 계속 추가하면서 250마이크로리터의 순차적 분획 20개를 수집합니다. 분수는 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.