JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 3:22 분 • April 30th, 2023
시작하려면 온전한 세포외 소포 또는 EV가 들어 있는 튜브를 가져갑니다.
원하는 부피의 용해 완충액에 EV를 현탁시키고 샘플을 초음파 처리합니다. 이 치료는 EV 막을 용해하고 유전 물질을 절단하여 단백질을 완충액으로 방출합니다.
원심분리하여 세포 파편과 전단된 유전 물질을 펠릿화합니다. 다양한 단백질을 함유한 상청액을 채취합니다.
단백질 추출물에 로딩 염료를 추가하고 SDS-PAGE 겔에서 실행합니다.
염료 분자가 단백질에 결합할 수 있도록 젤을 염색 용액에 담그십시오. 원하는 단백질이 포함된 염색된 밴드를 찾아 절제합니다.
후속 단계에서 효소에 대한 단백질의 접근성을 향상시키기 위해 유색 밴드를 작은 조각으로 자릅니다. 이 조각을 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
염색 염료를 제거하는 탈색 용액을 추가합니다. 사용한 탈색액을 제거합니다.
환원 용액을 추가합니다. 환원제가 단백질의 이황화 결합을 절단하여 유리 설프히드릴 그룹을 노출시키도록 배양합니다.
환원된 단백질을 알킬화 용액으로 처리합니다. 알킬기는 유리 설프히드릴 그룹에 결합하여 단백질을 풀어 유지합니다.
여분의 용액을 버리고 탈수 용액으로 조각을 세척하여 알킬화 시약을 제거합니다. 젤을 완전히 말리십시오.
이제 겔 조각이 추가 단백질체 분석을 위한 준비가 되었습니다.
단백질 추출을 위해 50마이크로리터의 RIPA 완충액을 EV 샘플과 얼음 위에서 5분 동안 혼합합니다. 샘플을 500와트 및 20킬로헤르츠에서 5초 동안 3회 초음파 처리합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 20,000 x g으로 원심분리하여 소포 파편을 제거합니다.
단백질을 분리한 후, 12% 폴리아크릴아미드 겔의 스태킹 겔에서 단백질 이동을 수행합니다. 실온에서 20분 동안 쿠마시 블루로 젤의 단백질을 고정합니다. 그런 다음 각 유색 젤 조각을 잘라내고 작은 조각으로 자릅니다.
원고에 설명된 대로 젤 조각을 일련의 연속적인 세척을 거칩니다. 그런 다음 진공 농축기로 완전히 건조시킵니다. 건조 후 섭씨 100도에서 100밀리몰 디티오스레이톨을 함유한 100밀리몰 중탄산암모늄 56마이크로리터로 단백질 환원을 수행합니다.
다음으로, 50밀리몰 요오도아세트아미드를 함유한 100마이크로리터의 100밀리몰 중탄산암모늄으로 어둠 속에서 45분 동안 단백질 알킬화를 수행합니다. 원고의 지시에 따라 젤 조각을 세척하고 진공 농축기에서 완전히 건조시킵니다.