형광 기반 트랜스웰 대식세포 유인 분석법: 화학적 유도 화학주성을 통한 종양-대식세포 상호작용을 연구하기 위한 체외 방법

고형 종양에 의해 방출되는 특정 화학적 유인제에 대한 반응으로 종양 관련 대식세포 또는 TAM과 같은 면역 세포가 고형 종양에 침윤합니다. 그 후, 이러한 TAM은 종양 진행을 촉진합니다.

시험관 내에서 TAM과 종양 세포 사이의 상호 작용을 연구하려면 막 삽입물이 있는 멀티웰 플레이트를 가져가는 것부터 시작하십시오. 이 배열은 일시적으로 우물을 두 개의 구획으로 분리합니다.

다음으로 트랜스웰의 상부 구획에 TAM 서스펜션을 추가합니다.

종양 세포에서 분비되는 화학적 유인제가 풍부한 조절된 배지로 트랜스웰의 하부 구획을 보충합니다.

원하는 시간 동안 플레이트를 배양합니다.

배양하는 동안 화학 조절제는 TAM을 끌어당깁니다. 이것은 화학적으로 유도된 화학주성을 통해 다공성 삽입막을 통해 TAM이 하부 구획으로 이동하게 합니다.

이제 웰에서 인서트를 제거합니다. 이주 TAM 집단을 포함하는 컨디셔닝 배지를 형광 측정에 적합한 플레이트로 옮깁니다.

형광 염료가 포함된 용해 완충액으로 세포를 처리합니다. 이 완충액은 대식세포를 용해시킵니다. 결국 염료 분자는 핵산에 결합하여 향상된 형광을 생성합니다.

마지막으로 형광 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 높은 형광은 화학적 유도 화학주성을 통해 대식세포가 성공적으로 이동했음을 나타냅니다.

먼저 필요한 재료를 실온으로 가져갑니다. 준비된 MV-4-11 세포 250마이크로리터를 각 인서트에 추가합니다. 다음으로, 400마이크로리터의 컨디셔닝된 배지/배지를 24웰 플레이트의 하부 챔버에만 추가하고 샘플을 세 번 추가해야 합니다.

섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 같은 웰의 내벽에 있는 인서트를 가볍게 두드리고 인서트를 버립니다. 웰의 세포를 위아래로 세 번 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.

이 세포 현탁액 225마이크로리터를 형광 측정에 적합한 검은색 벽 96웰 플레이트의 웰에 옮깁니다. 그런 다음 CyQuant 염료를 4x 용해 완충액으로 1:75의 비율로 희석합니다. 잠시 소용돌이치고 용액을 회전시킵니다.

이 용액 75마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 형광 플레이트 리더를 사용하여 형광을 읽고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.