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암 연구
0 조회수 • 4:02 분 • April 30th, 2023
신경구는 신경 전구체 세포 또는 NPC의 비부착 구형 응집체입니다.
특정 부착 배양 조건에서 도금할 때 NPC는 신경권에서 자발적으로 이동할 수 있습니다.
NPC의 이동 반응을 평가하려면 먼저 적절한 배지에서 원하는 밀도의 NPC 현탁액을 준비합니다.
다음으로, 세포 현탁액을 배지 함유 배양 플레이트에 시드하고 배양합니다.
배지의 특정 성장 인자는 세포의 증식을 지원합니다. 또한 코팅 기질이 없기 때문에 세포가 매체에 부유하여 신경구라고 하는 3D 세포 응집체를 형성하는 데 도움이 됩니다.
원하는 크기에 도달하면 신경구를 수집합니다.
희석된 배지에 신경구 펠릿을 원심분리하고 재현탁합니다.
그런 다음 신경구 현탁액을 희석된 배지가 들어 있는 세포외 매트릭스 코팅 플레이트에 도금하고 배양합니다.
배양하는 동안 신경구는 세포외 기질에 부착됩니다.
시간이 지남에 따라 세포외 기질의 구성 요소로 인해 소수의 NPC가 신경권 코어에서 멀어지기 시작합니다.
이제 미디어를 제거하고 셀을 고정합니다.
세포 이동을 나타내는 신경구의 위상차 이미지를 캡처합니다.
적절한 소프트웨어를 사용하여 전체 신경구의 면적과 내부 세포 질량을 측정합니다.
마지막으로 전체 신경구 면적에서 내부 세포 질량 면적을 빼서 신경구에서 평균 NPC 이동을 계산합니다.
신경구를 형성하려면 100% 팽창 배지 1밀리리터를 코팅 기판 없이 35mm 접시에 피펫팅합니다. 그런 다음 각 플레이트에 100만 개의 신경 전구체 세포를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 48-96시간 동안 배양합니다.
신경구 이동을 위해 플레이트를 준비하려면 ECM-모방 겔 분취량을 30% 팽창 배지 6밀리리터에 용해시킵니다. 6웰 플레이트의 단일 웰에 30% 확장 배지와 함께 1밀리리터의 ECM-모방 겔을 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
신경구를 플레이트화하려면 피펫을 사용하여 35mm 접시에서 배지의 세포를 수집하고 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 100 x g으로 회전시켜 신경구를 펠릿화합니다. 그런 다음 펠릿을 예열된 30% 팽창 배지의 1-3밀리리터에 재현탁합니다.
다음으로, 재현탁된 신경구 200마이크로리터를 30% 팽창 배지가 있는 ECM-모방 겔이 포함된 6웰 플레이트에 피펫팅하고 플레이트를 흔듭니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. ECM-모방 겔을 30% 확장 배지로 흡인한 다음 4% 파라포름알데히드를 사용하여 30분 동안 세포를 고정합니다.
신경구를 분석하려면 위상차 설정을 사용하여 10X 배율로 이미지를 캡처합니다. NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 신경구의 평균 이동을 측정합니다. ImageJ에서 자유형 선 도구를 사용하여 신경구의 외부 윤곽을 추적합니다.
그런 다음 측정 함수를 사용하여 추적 영역을 계산하고 구의 내부 셀 질량을 추적합니다. 평균 이동을 정량화하기 위해 전체 신경구 면적에서 내부 세포 질량을 뺍니다.