EV 분리 시 왜 고속 원심분리 단계 전에 저속 원심분리를 수행하나요?

500 x g의 저속 원심분리를 통해 세포와 조직 파편을 침전시키고 세포외 소포체는 상층액에 남겨둠으로써, EV 손실 없이 초기 부유물을 제거할 수 있습니다. 이 단계는 추가 정제 전 균질액을 투명하게 만들어 후속 EV 집단의 순도를 높여줍니다. 이는 이후의 원심분리 및 여과 단계에 영향을 줄 수 있는 큰 오염 물질을 제거하는 데 필수적입니다.

0.45µm 필터를 이용한 여과가 EV 정제에 어떻게 기여합니까?

여과 과정은 이전의 원심분리 단계에서 침전되지 않은 잔류 세포사멸체(apoptotic bodies)와 더 큰 소낭들을 제거하여, 작은 크기의 EV 집단만을 농축합니다. 이 단계는 0.45 µm 미만의 EV만이 초원심분리로 진행되도록 하여, 더 큰 파편에 의한 오염을 줄여줍니다. 이는 100,000 x g 원심분리 후 얻어지는 최종 EV 펠릿의 특이성을 높여줍니다.

0.25-molar sucrose 용액으로 EV 펠렛을 재부유하는 목적은 무엇입니까?

자당 용액은 등장성 환경을 조성하여 초원심분리 후 EV의 형태와 구조적 무결성을 유지하는 데 도움을 줍니다. 이는 보관 또는 취급 중에 소포체에 손상을 줄 수 있는 삼투압 충격을 방지합니다. EV의 무결성을 유지하는 것은 후속 기능 분석 및 소포체 집단의 정확한 특성 분석에 매우 중요합니다.

왜 EV 현탁액을 4°C에서 보관해야 합니까?

4°C에서 보관하면 EV의 안정성이 유지되며, 이후의 하위 애플리케이션에 사용하기 전까지 분해 또는 응집을 방지할 수 있습니다. 이 온도는 동결 없이 소포의 무결성을 보존하며, 동결은 막 구조를 손상시킬 수 있습니다. 이는 일관되고 안정적인 EV 조제물을 제공함으로써 실험 간의 재현성을 높여줍니다.

Dounce homogenizer를 이용한 기계적 해리가 조직으로부터의 EV 수율을 어떻게 향상시키나요?

느슨하게 맞물린 Dounce homogenizer로 약 30회 천천히 스트로크 하면, 배양 후 조직이 부드럽게 해리되어 세포와 세포외 소포체가 완충액으로 방출됩니다. 이 기계적 단계는 EV를 손상시킬 수 있는 과도한 전단력 없이 조직 구조를 분해함으로써 효소적 해리를 보완합니다. 이를 통해 EV의 구조적 무결성을 유지하면서 간질 공간으로부터 EV가 효율적으로 방출되도록 합니다.

Extracellular Vesicle Extraction: 차등 원심분리를 사용하여 전체 조직 표본에서 세포외 소포를 분리하는 기술

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구

0 조회수 • 4:13 분 • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전체 조직에서 세포외 소포 또는 EV는 세포에 의해 간질액으로 방출됩니다. 여기에는 세포사멸체, 미세소포 및 엑소좀이 포함됩니다. EV는 세포 간 통신을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.

EV를 추출하려면 먼저 전체 조직 샘플을 채취하십시오.

적절한 해리 완충액으로 조직을 처리합니다. 해리 완충액의 성분은 조직에 존재하는 세포외 기질을 분해하여 결국 세포를 느슨하게 합니다.

현탁액을 균질화기로 옮기고 조직을 기계적으로 더 파괴하여 해리시키고 세포를 방출합니다.

다음으로, 균질액을 저속으로 원심분리하여 EV가 상청액에 남아 있는 동안 세포와 조직 조각을 펠릿화합니다.

상청액을 새 튜브에 넣습니다. 고속으로 원심분리하여 대부분의 대형 세포사멸체를 펠릿화하고 더 작은 크기의 EV를 상청액에 남깁니다.

EV 함유 상청액을 주사기에 모으십시오. 구성 요소를 필터링하여 남아 있는 세포사멸체를 제거하고 작은 크기의 EV 개체군을 수집합니다.

여과액을 원심분리하여 펠릿에서 EV를 얻습니다. 남은 완충액을 버리고 EV 펠릿을 자당 용액에 재현탁합니다. 이 솔루션은 EV가 형태를 유지할 수 있는 등장성 환경을 조성합니다.

이제 EV 서스펜션을 더 사용할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.

시작하려면 조직 0.4 내지 1.0g당 Hibernate-E 배지에 10밀리리터의 해리 완충액을 준비합니다. 전체 신선 또는 냉동 조직을 50밀리리터 튜브의 완충액에 넣고 섭씨 37도의 따뜻한 수조에서 20분 동안 배양합니다.

그 후, 해리 완충액에서 최종 1x 농도를 위해 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 첨가합니다. 티슈와 함께 용액을 느슨한 Dounce 균질화기에 붓습니다. 샘플당 약 30번의 느린 스트로크를 사용하여 조직을 부드럽게 해리시킵니다.

그런 다음 해리된 조직과 완충 용액을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 500 x g 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 나머지 섬유질 또는 응집성 조직 조각을 펠릿화합니다.

상청액을 깨끗한 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 2,000 x g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 큰 세포 파편을 펠릿화하고 버립니다.

이 상청액을 깨끗한 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 10,000 x g 및 섭씨 4도에서 40분 동안 원심분리하여 원치 않는 큰 소포 또는 작은 세포사멸체를 펠릿화합니다. 0.45마이크로미터 필터를 통해 깨끗한 12밀리리터 초원심분리 튜브에 상청액을 디캔팅합니다.

다음으로, 샘플을 100,000 x g 및 섭씨 4도에서 2시간 동안 초원심분리하여 작은 EV를 펠릿화합니다. 상층액을 디캔팅하고 초원심분리 튜브를 5-10분 동안 거꾸로 두드려 튜브 측면에 남아 있는 액체를 제거합니다.

관련 동영상

0 조회수

마지막 업데이트: 15 8월 2026

Extracellular Vesicle Extraction: 차등 원심분리를 사용하여 전체 조직 표본에서 세포외 소포를 분리하는 기술

개요

주요 연구 구성 요소

과학 분야

배경

연구 목적

사용된 방법

주요 결과

결론

자주 묻는 질문

산업적 관련성 요약

바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용

초기 발견 및 타겟 검증

스크리닝 및 분석법 개발

중개 및 전임상 연구

파이프라인 및 워크플로우 통합

운영 및 기업 영향

실행 시 고려 사항

바이오 제약 FAQ

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

간에서 조직 세포 외 소포의 격리

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구