Purification of subpopulations of extracellular vesicles: A technique to purify subpopulations of extracellular vesicles using Density Gradient Ultracentrifugation(밀도 구배 초원심분리를 사용하여 세포외 소포의 하위 집단을 정제하는 기술)

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구

0 조회수 • 4:27 분 • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포외 소포 또는 EV는 뇌종양 세포를 포함한 다양한 세포에서 분비되는 나노 크기의 이질적인 막 결합 소포입니다. 소형 EV는 엔도좀 유래 EV와 막 탈폐 EV로 구성된 하위 집단입니다.

소형 EV를 정제하려면 균질한 용액을 유지하고 EV의 구조적 무결성을 보존하는 자당 보충 완충액에 현탁된 사전 추출된 EV를 섭취하는 것부터 시작하십시오.

그런 다음 이 용액에 적절한 양의 요오딕산올(불활성 및 무독성 밀도 구배 매체)을 추가하여 원하는 밀도를 얻습니다.

요오딕사놀은 나중에 제거될 오염 단백질을 가용화합니다.

다음으로, 밀도가 연속적으로 감소하는 요오딕산올 용액 층을 추가하여 불연속적인 밀도 구배를 만듭니다.

튜브를 고속으로 원심분리합니다.

부유율에 따라 밀도가 높은 EV는 똑같이 밀도가 높은 구배 매체 층으로 이동하고, 밀도가 낮은 EV는 더 가벼운 층으로 이동하고, 가장 밀도가 높은 오염 물질은 튜브 바닥에 펠릿을 형성합니다.

이제 적절한 완충액이 포함된 새 튜브에 그래디언트 층의 작은 부분을 옮깁니다.

그 후, 냉각 조건에서 튜브를 초고속으로 원심분리합니다.

원심분리 중 저온은 EV가 고속으로 인한 열 손상을 방지합니다.

순수 EV가 펠릿으로 내려간 후 상층액을 제거합니다. EV를 적절한 완충액에 재현탁하고 특성화 및 단백질체학 분석을 진행합니다.

먼저, EV가 포함된 자당/트리스 완충액 1.5밀리리터에 60% 요오딕사놀 1.5밀리리터를 첨가하여 30% 요오딕산올을 함유한 최종 용액을 만듭니다. 용액을 완전히 혼합하기 위해 위아래로 여러 번 피펫팅합니다.

이 용액을 5.5밀리리터 초원심분리 튜브의 바닥으로 옮깁니다. 다음으로, 60% 요오딕산올 스톡을 초순수와 혼합하여 최소 1.5밀리리터의 20% 및 10% 요오딕산올 용액을 준비합니다.

주사기와 18G 바늘을 사용하여 1.3% 요오딕산올 용액 20밀리리터를 측정하고 하단 구배 위에 조심스럽게 겹겹이 쌓습니다.

바늘의 경사를 메니스커스 바로 위의 튜브 내부와 접촉하게 유지하고 밀도 계면에서 층이 혼합되지 않도록 용액을 적방적으로 추가합니다.

그런 다음 동일한 기술을 사용하여 20% 층 위에 10% 요오딕산올 용액 1.2밀리리터를 층층으로 층춥니다. 초원심분리 튜브의 균형을 조심스럽게 맞추고 로터 버킷에 넣습니다.

스윙 버킷 로터의 가속 및 감속 속도를 최소 속도로 설정하고 268,000 x g 및 섭씨 4도에서 50분 동안 원심분리합니다.

샘플을 원심분리하는 동안 밀도 구배의 분획 1에서 10에 해당하는 각 샘플에 대해 10밀리리터 미세 원심분리기 튜브 10개에 라벨을 붙입니다.

원심분리가 완료되면 로터 버킷에서 튜브를 부드럽게 제거하고 안정적인 홀더에 넣습니다. 구배 상단에서 490마이크로리터의 연속 분획 10개를 해당 튜브로 피펫팅합니다.

굴절계를 사용하여 분수의 굴절률을 측정합니다. 그런 다음 각 분획을 깨끗한 12밀리리터 초원심분리 튜브로 옮깁니다.

각 튜브에 5밀리리터의 1x PBS를 넣고 천천히 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브 상단에 1x PBS 6밀리리터를 추가로 넣고 조심스럽게 다시 혼합합니다.

튜브를 섭씨 100,000 x g 및 섭씨 4도에서 초원심분리하여 작은 소포를 다시 펠릿화합니다. 단백질 분석을 위해 소포를 용해하거나 형태학적 분석을 위해 EV를 재현탁하기 전에 상청액을 디캔팅하고 튜브를 두드려 건조시킵니다.

09:18

Extracellular 소포 Murine Bronchoalveolar 게 유체는 한 원심 분리 기법을 사용 하 여에서 격리

관련 동영상

0 조회수

07:15

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

관련 동영상

0 조회수

08:27

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

관련 동영상

0 조회수

03:15

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

관련 동영상

0 조회수

04:13

Extracellular Vesicle Extraction: 차등 원심분리를 사용하여 전체 조직 표본에서 세포외 소포를 분리하는 기술

관련 동영상

0 조회수

09:03

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

관련 동영상

0 조회수

09:56

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

관련 동영상

0 조회수

08:44

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

관련 동영상

0 조회수

10:46

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

관련 동영상

0 조회수

10:16

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

관련 동영상

0 조회수

마지막 업데이트: 15 8월 2026