성상세포 분리: 마우스 피질 성상세포의 순수한 준비를 얻는 방법

체외 성상세포 배양은 가장 풍부한 뇌 세포인 성상세포의 생물학적 역할을 조사하는 데 도움이 됩니다.

부 현미경 아래에 놓인 신생아 마우스 뇌부터 시작합니다.

후각 구근과 소뇌를 제거합니다.

피질을 분리하기 위해 두 반구 사이에 정중선 절개를 수행합니다.

섬유아세포와 수막 세포로부터 성상세포 배양의 오염을 방지하기 위해 수막을 제거합니다.

피질 반구를 얼음처럼 차가운 매체로 옮기고 작은 조각으로 다집니다.

트립신이 들어 있는 튜브에 피질 조각을 수집합니다. 프로테아제 효소인 트립신은 세포 접착 단백질을 소화하여 세포 분리를 촉진합니다.

소화된 조직을 펠릿화하기 위해 원심분리합니다.

상청액을 제거하고 펠릿에 성상세포 배지를 첨가합니다. 성상세포, 미세아교세포 및 희소돌기아교세포 전구체 세포 또는 OPC의 혼합 세포 집단을 방출하기 위해 힘차게 피펫팅합니다.

이 세포 현탁액을 폴리-라이신 코팅 조직 배양 플라스크에 시드하고 배양합니다.

음전하를 띤 세포는 양전하를 띤 폴리라이신에 부착되어 전체 표면에 걸쳐 성장하여 합류층을 형성합니다.

플라스크를 흔들어 느슨하게 결합된 미세아교세포와 OPC를 분리합니다. 분리된 세포가 포함된 상청액을 제거합니다.

성상세포층에 트립신을 첨가합니다. 세포를 모으고 원심분리합니다.

펠릿을 재현탁하고 성상세포를 여러 플라스크로 나눕니다.

마지막으로, 세포 특이적 마커를 면역염색하여 성상세포 배양의 순도를 평가합니다.

뇌가 들어 있는 접시를 실체 현미경으로 옮깁니다. 다음으로 피질을 분리하기 위해 미세한 겸자로 각 뇌의 뒤쪽 끝을 잡고 반구 사이의 정중선 절개를 수행합니다.

그런 다음 생성된 홈에 두 번째 집게를 삽입하고 뇌의 나머지 부분에서 피질의 판 모양 구조를 벗겨냅니다.

모든 피질이 분리되면 미세한 집게로 당겨 피질에서 수막을 조심스럽게 떼어냅니다. 이 단계는 수막 세포와 섬유아세포에 의한 최종 성상세포 배양의 오염을 방지합니다.

준비된 피질 반구를 식힌 HBSS로 채워진 두 번째 접시에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 그에 따라 4개의 피질 모두를 계속하십시오. 마지막으로 날카로운 칼날을 사용하여 각 반구를 4-8개의 작은 조각으로 자릅니다.

멸균 상태에서 피질 조각을 하나의 50밀리리터 팔콘 튜브로 옮기고 HBSS를 최종 부피 22.5밀리리터까지 추가합니다. 그런 다음 2.5% 트립신 2.5밀리리터를 추가합니다.

캡을 교체하고 혼합한 다음 조직을 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 10분마다 흔들어 섞습니다. 그런 다음 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 피질 조직 조각을 펠릿화한 후 상청액을 조심스럽게 디캔팅합니다.

펠릿에 성상세포 도금 배지 10밀리리터를 첨가하고, 10밀리리터 피펫을 이용하여 단일 세포 현탁액이 얻어질 때까지 조직을 함유한 배지를 상하로 20 내지 30회 세게 피펫팅한다.

다음으로, 성상세포 도금 배지를 최종 부피 20밀리리터에 첨가하고 표준 절차에 따라 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.

4개의 마우스 새끼 피질의 1회 제제는 10 내지 15배 10 내지 6번째 해리된 단일 세포를 산출해야 한다. 마지막으로, 이전에 준비된 플라스크에서 폴리-D-라이신을 흡인하고 해리된 세포 현탁액을 플라스크로 옮깁니다.

조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2일 동안 배양한 다음 배지를 교체합니다. 그 후 3일마다 미디어를 교체해야 합니다.

성상세포는 배양에서 7-8일 후에 미세아교세포의 위에 있는 층과 합류하는 것처럼 보여야 합니다. 이 시점에서 T75 플라스크를 분당 180회전으로 설정된 궤도 셰이커에 30분 동안 설정하여 미세아교세포를 제거합니다.

미세아교세포가 포함된 상청액을 버리거나 회전시켜 배양을 위해 도금합니다. 그런 다음 신선한 성상세포 배양 배지 20밀리리터를 넣고 플라스크를 240rpm에서 6시간 동안 흔들어 희소돌기아교세포 전구체 세포를 제거합니다.

일부 OPC는 성상세포층에서 완전히 분리되지 않으므로 OPC 오염을 방지하기 위해 1분 동안 손으로 계속 세게 흔듭니다. 다시 말하지만, 상청액을 버리거나 접시에 돌려 OPC를 배양합니다.

나머지 합류 성상세포 층을 PBS로 두 번 헹구십시오. PBS를 흡인하고 트립신-EDTA 5밀리리터를 첨가합니다. 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 배양합니다.

5분마다 성상세포의 박리를 확인하고 플라스크를 손바닥에 두세 번 두드려 성상세포의 박리를 강제합니다.

성상세포가 플라스크에서 분리되면 성상세포 배양 배지 5밀리리터를 추가합니다. 세포를 180 x g에서 5분 동안 회전시키고 상청액을 흡인한 다음 40밀리리터의 신선한 성상세포 도금 배지를 추가합니다.

혼합 피질 세포의 T75 플라스크 1개는 첫 번째 계대 후 성상세포가 풍부한 여섯 번째 세포에서 약 10배의 10을 산출해야 합니다.