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암 연구
0 조회수 • 8:27 분 • April 30th, 2023
뇌 내피 세포를 분리하려면 먼저 수확한 쥐의 뇌를 냉장 완충액이 들어 있는 접시에 옮깁니다.
소뇌와 시신경을 제거한 후 뇌를 대뇌 반구로 나눕니다. 그런 다음 중뇌를 전뇌에서 분리합니다.
전뇌에서 수막과 미엘린[함유 백질을 제거하고 미세혈관을 분리하기 위해 뇌 피질을 남깁니다.
다음으로, 피질을 균질화하여 신경 조직과 성분을 파괴합니다.
균질을 원심분리하여 세포 파편과 미엘린을 제거합니다.
그 후, 콜라게나제, 디스파아제 및 데옥시리보뉴클레아제 효소를 함유한 소화 칵테일로 조직 펠릿을 처리합니다.
콜라게나제와 분산제는 미세혈관을 매립하는 세포외 기질을 소화하여 조직에서 미세혈관 조각을 느슨하게 합니다. 데옥시리보뉴클레아제는 용해된 세포에서 방출된 유리 DNA를 분해합니다.
소화된 균질의 원하는 부피를 적절한 밀도 구배 배지 및 원심분리기와 혼합합니다.
미엘린과 뇌 실질 세포가 함유된 최상층을 버리고 그 다음에 상청액을 버립니다.
이제 마이크로혈관 함유 펠릿을 소화 칵테일로 처리하여 내피 세포와 주위 세포를 포함하는 미세혈관 조각을 완전히 방출합니다.
현탁액을 원심분리합니다. 항생제인 퓨로마이신이 보충된 적절한 배지에 미세혈관 단편 함유 펠릿을 재현탁합니다.
현탁액을 세포외 기질 단백질 코팅 플레이트에 시드하고 배양합니다.
미세혈관 조각은 플레이트의 코팅에 부착됩니다. 퓨로마이신은 주위 세포를 선택적으로 제거하는 반면, 배지 성분은 내피 세포의 증식을 촉진합니다.
5주 된 Wistar 쥐 세 마리의 두개골에서 뇌를 제거하고 얼음 위에 보관된 차가운 해부 완충액으로 채워진 페트리 접시에 뇌를 옮깁니다.
소뇌와 시신경이 없는 뇌를 해부합니다. 그런 다음 각 뇌를 반으로 잘라 두 개의 대뇌 반구를 분리합니다.
입체 현미경 아래에서 또 다른 절단을 하여 중뇌를 제거하고 모든 전뇌를 해부 완충액이 있는 얼음 위의 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.
그런 다음 한쪽 전뇌를 차가운 해부 완충액으로 채워진 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 클램프로 잡고 전뇌 가장자리에서 수막을 조심스럽게 분리합니다.
그런 다음 전뇌를 뒤집어 수막을 찢지 않고 조심스럽게 떼어냅니다. 전뇌에서 수막이 제거되었는지 확인하고 시신경의 나머지 부분을 절단하십시오. 이 단계의 목적은 피질 껍질을 얻기 위해 백질 이불을 제거하는 것입니다.
전뇌의 가장자리를 조이는 것부터 시작한 다음 피질 표면이 찢어지지 않도록 주의하면서 표면을 따라 집게를 조심스럽게 드래그합니다.
그런 다음 뇌를 굴려 뇌에 수막이 없는지 확인하여 잔여 수막이나 큰 표면 혈관이 없는지 확인합니다.
다음으로, 두개골에서 세 개의 뇌를 추출하는 것부터 시작하여 해부를 위한 전체 시간은 조직 보존 및 세포 생존을 위해 2시간 이상 걸리지 않아야 합니다. 3개의 뇌 피질을 7밀리리터 Dounce 균질화기에서 6밀리리터의 저온 해부 완충액으로 옮깁니다.
그 후, 더 큰 간격의 첫 번째 유봉으로 10번의 위아래 스트로크로 피질을 해리시킨 다음 더 작은 간격의 두 번째 유봉으로 10번의 위아래 스트로크
를 합니다.그런 다음 현탁액 6밀리리터를 새 50밀리리터 Falcon 튜브에 옮기고 Dounce 균질화기를 24밀리리터의 저온 해부 완충액으로 세척합니다. 현탁액을 3개의 Falcon 튜브로 나누어 튜브당 하나의 피질에 해당하는 것을 얻습니다.
그 후, 실온에서 5분 동안 1000 x g으로 원심분리합니다. 펠릿을 관찰하면 피질 균질의 미세혈관 부분을 나타내는 분홍색의 그라데이션이 나타납니다.
이제 상청액을 버리고 콜라게나제, 분산효소, DNase 유형 1 및 겐타마이신의 혼합물을 포함하는 효소 용액 1밀리리터로 한 피질에서 펠릿을 균질화합니다.
튜브를 섭씨 30도에서 37분 동안 셰이커에 넣습니다. 그런 다음 1밀리리터의 분해물과 10밀리리터의 25% BSA/HBSS 1X를 혼합하고 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 합니다. 그 후, 실온에서 15분 동안 3,600 x g에서 밀도 의존적 원심분리를 통해 분리합니다.
밀도 의존적 원심분리 후 펠릿에는 미세혈관이 포함되고 상부 디스크에는 미엘린, 뇌 실질 및 잔여 미세혈관이 포함됩니다.
상부 디스크와 상청액을 깨끗한 50밀리리터 Falcon 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 미세혈관 펠릿을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
튜브를 부드럽게 소용돌이치고 밀도 의존적 원심분리를 반복합니다. 이 두 번째 원심분리 동안 미세혈관을 포함하는 결과 펠릿을 섭씨 4도에서 유지합니다.
두 번째 밀도 의존적 원심분리 후 상부 디스크와 상청액을 조심스럽게 버립니다. 두 원심분리에서 미세혈관을 포함하는 생성된 펠릿을 1밀리리터의 차가운 HBSS 1X와 혼합하고 재현탁합니다.
다음으로, 20밀리리터의 차가운 HBSS 1X로 미세혈관을 세척하고 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 미세혈관 펠릿을 잃지 않도록 주의하면서 상청액을 버립니다.
튜브의 부드러운 소용돌이에 따라 동일한 효소 용액 1밀리리터로 하나의 피질에서 미세혈관 펠릿을 균질화합니다. 또한 셰이커에서 섭씨 1도에서 37시간 동안 미세혈관을 소화합니다. 그런 다음 세 개의 피질에서 소화된 미세혈관을 하나의 튜브에 혼합합니다.
다시 혼합물을 2개의 50밀리리터 팔콘 튜브로 분리하여 튜브당 피질 1.5개에 해당하는 양에서 추출된 미세혈관을 얻습니다. 그런 다음 실온에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
미세용기를 도금하기 직전에 인큐베이터에서 코팅된 T75 플라스크 2개를 꺼내 과도한 코팅을 흡인합니다. 상청액을 버리고 마이크로혈관 펠릿을 ECM 1밀리리터에 재현탁합니다.
퓨로마이신 밀리리터당 4마이크로그램을 보충한 ECM으로 각 튜브를 10밀리리터로 가져와 정제 과정을 시작하고 플라스크에 미세혈관을 도금합니다.
그런 다음 플라스크를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣어 콜라겐-피브로넥틴 매트릭스에 미세혈관이 접착되도록 합니다.