쥐 뇌 미세혈관에서 내피 세포 배양: 쥐 뇌의 미세혈관에서 내피 세포를 분리 및 배양하는 절차

뇌 내피 세포를 분리하려면 먼저 수확한 쥐의 뇌를 냉장 완충액이 들어 있는 접시에 옮깁니다.

소

뇌와 시신경을 제거한 후 뇌를 대뇌 반구로 나눕니다. 그런 다음 중뇌를 전뇌에서 분리합니다.

전뇌에서 수막과 미엘린[함유 백질을 제거하고 미세혈관을 분리하기 위해 뇌 피질을 남깁니다.

다음으로, 피질을 균질화하여 신경 조직과 성분을 파괴합니다.

균질을 원심분리하여 세포 파편과 미엘린을 제거합니다.

그 후, 콜라게나제, 디스파아제 및 데옥시리보뉴클레아제 효소를 함유한 소화 칵테일로 조직 펠릿을 처리합니다.

콜라게나제와 분산제는 미세혈관을 매립하는 세포외 기질을 소화하여 조직에서 미세혈관 조각을 느슨하게 합니다. 데옥시리보뉴클레아제는 용해된 세포에서 방출된 유리 DNA를 분해합니다.

소화된 균질의 원하는 부피를 적절한 밀도 구배 배지 및 원심분리기와 혼합합니다.

미엘린과 뇌 실질 세포가 함유된 최상층을 버리고 그 다음에 상청액을 버립니다.

이제 마이크로혈관 함유 펠릿을 소화 칵테일로 처리하여 내피 세포와 주위 세포를 포함하는 미세혈관 조각을 완전히 방출합니다.

현탁액을 원심분리합니다. 항생제인 퓨로마이신이 보충된 적절한 배지에 미세혈관 단편 함유 펠릿을 재현탁합니다.

현탁액을 세포외 기질 단백질 코팅 플레이트에 시드하고 배양합니다.

미세혈관 조각은 플레이트의 코팅에 부착됩니다. 퓨로마이신은 주위 세포를 선택적으로 제거하는 반면, 배지 성분은 내피 세포의 증식을 촉진합니다.

5주 된 Wistar 쥐 세 마리의 두개골에서 뇌를 제거하고 얼음 위에 보관된 차가운 해부 완충액으로 채워진 페트리 접시에 뇌를 옮깁니다.

소

뇌와 시신경이 없는 뇌를 해부합니다. 그런 다음 각 뇌를 반으로 잘라 두 개의 대뇌 반구를 분리합니다.

입체 현미경 아래에서 또 다른 절단을 하여 중뇌를 제거하고 모든 전뇌를 해부 완충액이 있는 얼음 위의 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.

그런 다음 한쪽 전뇌를 차가운 해부 완충액으로 채워진 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 클램프로 잡고 전뇌 가장자리에서 수막을 조심스럽게 분리합니다.

그런 다음 전뇌를 뒤집어 수막을 찢지 않고 조심스럽게 떼어냅니다. 전뇌에서 수막이 제거되었는지 확인하고 시신경의 나머지 부분을 절단하십시오. 이 단계의 목적은 피질 껍질을 얻기 위해 백질 이불을 제거하는 것입니다.

전뇌의 가장자리를 조이는 것부터 시작한 다음 피질 표면이 찢어지지 않도록 주의하면서 표면을 따라 집게를 조심스럽게 드래그합