제브라피시 유충에서 뇌 세포 분리: 제브라피시 뇌 조직에서 온전한 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포를 얻는 기술

제브라피쉬의 뇌는 정보 처리에 중요한 역할을 하는 신경 세포인 뉴런으로 구성됩니다. 또한 이는 신경간 공간에 서식하는 대식세포 및 미세아교세포를 포함한 지지 면역 세포 집단으로 구성됩니다.

제브라피쉬에서 이러한 모든 유형의 뇌 세포를 분리하려면 먼저 적절한 배지가 들어 있는 페트리 접시에 마취된 제브라피쉬 유충을 채취합니다.

실체 현미경으로 제브라피시를 시각화하고 뇌를 온전하게 유지하기 위해 난황낭 위의 유충 머리를 횡단합니다.

절제된 헤드를 미리 냉각된 배지로 채워진 균질화기에 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 낮은 온도는 뇌 세포의 분해를 방지하는 데 도움이 됩니다.

유봉으로 제브라피쉬 뇌 조직을 균질화합니다. 균질화는 세포외 기질을 분해하고 뇌 조직에서 뉴런, 대식세포 및 미세아교세포의 해리를 시작합니다.

이 단계는 또한 지질이 풍부한 절연층인 미엘린을 뉴런에서 분리합니다.

균질을 스트레이너에 통과시켜 큰 세포 덩어리를 포획합니다.

여과액을 원심분리하여 세포와 수초초 조각을 펠릿화합니다. 파편이 포함된 상층액을 버립니다.

펠릿을 적절한 밀도 구배 배지에 재현탁하고 완충액으로 오버레이합니다.

튜브를 저속으로 회전시킵니다. 더 가벼운 미엘린 단편은 완충액과 밀도 구배 배지의 경계면에서 뚜렷한 밴드를 형성하는 반면, 밀도가 높은 세포는 바닥에 침전합니다.

최상층을 흡인하고 추가 사용을 위해 뇌 세포를 신선한 배지에 재현탁합니다.

취를 준비하기 위해 배지 50밀리리터에서 50마리의 유충당 1.5밀리리터의 15밀리몰 트리카인을 첨가합니다. 그런 다음 3밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 한 번에 10마리의 유충을 트리카인이 함유된 얼음처럼 차가운 E3 배지로 채워진 55mm 페트리 접시에 옮겨 최종 마취합니다.

실체 현미경으로 페트리 접시 중앙에 10마리의 유충을 정렬합니다. 그런 다음 수술용 가위를 사용하여 난황낭 위의 유충 머리를 절개합니다.

3밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 모든 헤드를 잡고 가능한 한 적은 액체로 얼음처럼 차가운 미디어 A 1밀리리터가 들어 있는 얼음 위의 유리 균질화기로 옮깁니다.

얼음처럼 차가운 E3와 트리카인이 들어 있는 각 작은 페트리 접시를 30분마다 새 페트리 접시로 교체하여 차가운 E3와 트리카인 배지에서 절개가 수행되도록 합니다.

색상이 바래기 시작하면 유리 균질화기에 얼음처럼 차가운 미디어 A를 교체하십시오. 전체 헤드 그룹이 수집되면 유리 균질화기에서 모든 배지 A를 제거하고 1밀리리터의 신선한 얼음처럼 차가운 배지 A로 교체합니다.

균질화기가 얼음 위에 있는 상태에서 꼭 맞는 유봉을 사용하여 3-5dpf 유충에 대해 40회 분쇄 및 회전, 7-8dpf 유충에 대해 50회 분쇄 및 회전을 수행하여 뇌 조직을 교란시킵니다.

그런 다음 세포 현탁액에 2밀리리터의 배지 A를 첨가하여 세포를 희석하고 미엘린과의 응집을 줄입니다. 세포 현탁액을 40미크론 세포 여과기를 통해 얼음 위의 차가운 50밀리리터 팔콘 튜브로 흘려 세포 응집을 제거합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.

세포 현탁액 1밀리리터 분취량을 차가운 1.5mm 튜브에 옮기고 섭씨 300 x g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 23G x 1" 바늘이 있는 10밀리리터 주사기를 사용하여 상청액을 제거합니다.

음처럼 차가운 22% 밀도 구배 배지 1밀리리터를 얼음처럼 차갑게 차가운 1x DPBS 0.5밀리리터로 부드럽게 겹쳐서 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 튜브를 쉬지 않고 950 x g으로 회전시키고 섭씨 4도에서 30분 동안 천천히 가속합니다.

스핀 후 DPBS 밀도 구배 배지와 계면에 갇힌 미엘린을 폐기합니다. 그런 다음 2% NGS가 포함된 0.5mm의 배지 A를 사용하여 세포를 세척하고 튜브를 섭씨 4도에서 300 x g으로 10분 동안 회전시킵니다.

많은 상청액을 제거한 다음 동일한 실험 조건에서 세포 펠릿을 2% NGS가 포함된 배지 A 1밀리리터에 함께 당겨 당깁니다.

관심 세포가 형광 단백질을 발현하는 경우, 세포 현탁액을 35미크론 세포 스트레이너 캡을 통해 흐르고 빛으로부터 보호된 얼음 위의 차가운 5밀리리터 FACS 튜브로 옮깁니다.