말초혈액 단핵세포(PBMNC)에서 유도 신경 줄기세포(iNSC) 생성: PBMNC를 iNSC로 재프로그래밍하는 센다이 바이러스 기반 절차

체세포를 유도 신경 줄기 세포 또는 iNSC(높은 자가 재생 및 분화 능력을 가진 줄기 세포)로 재프로그래밍하려면 먼저 무혈청 배지에서 말초 혈액 단핵 세포를 배양하여 적혈구를 확장합니다.

다음으로, 적혈구 현탁액을 배양 플레이트에 피펫팅합니다. 재조합 센다이 바이러스 또는 SeV로 세포를 처리합니다. 이 바이러스는 재프로그래밍 전사 인자를 암호화합니다. 원심분리하여 세포를 침전시키고 배양합니다.

숙주 세포막에 SeV가 융합된 후 바이러스 게놈은 전사를 거친 후 세포질에서 번역됩니다. 전사 인자의 이소성 발현은 유전자를 숙주 게놈에 통합하지 않고 세포 재프로그래밍 과정을 촉발합니다.

이제 배양액을 원심분리하여 바이러스를 제거합니다. 형질도입된 세포를 적절한 배지에 재현탁한 후 도금합니다. 또한 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. iNSC 배지에 세포를 재현탁합니다.

그런 다음 단백질 코팅 플레이트에 세포를 시드합니다. 세포는 플레이트의 단백질 코팅에 부착됩니다. 격일로 iNSC 배지로 부착된 세포를 보충합니다. 배양 일주일 후, 사용한 배지를 매일 신선한 iNSC 배지로 교체하십시오.

배지의 성장 인자와 화학 성분은 자가 재생을 유지하고 형질도입된 세포의 하위 집합의 다능성을 지원하여 iNSC로 완전히 재프로그래밍합니다. 시간이 지남에 따라 세포는 iNSC 콜로니를 형성하기 시작합니다. 배양할 식민지를 선택합니다.

0일째에 MNC 배지에 세포를 수집하고 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세포를 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 흡인하고 예열된 MNC 배지 1밀리리터로 세포를 재현탁합니다. Trypan Blue로 생존 세포를 계수한 다음 예열된 MNC 배지로 24웰 플레이트에서 웰당 200,000개 세포의 농도로 재현탁합니다.

센다이 바이러스가 들어 있는 영하 80도의 저장고에서 꺼낸 튜브를 섭씨 37도의 수조에서 5-10초 동안 해동한 후 실온에서 해동합니다. 해동되면 즉시 얼음 위에 놓습니다. 해동된 센다이 바이러스를 10의 감염 다중도에서 MNC가 있는 24웰 플레이트의 웰에 추가합니다. 세포의 부착을 용이하게 하기 위해 플레이트를 1,000 x g에서 30분 동안 원심분리한 후 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다.

1일째에 배지가 있는 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 나머지 세포를 추가로 분리하려면 웰당 1밀리리터의 MNC 배지로 웰을 헹구고 배지가 포함된 세포를 튜브에 추가합니다. 이 세포 현탁액을 200 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 흡인하고, 500마이크로리터의 신선한 예열된 MNC 배지로 세포를 재현탁한 후 24웰 플레이트의 웰에 첨가한다.

2일째에 이전에 희석된 폴리-D-라이신 및 D-PBS당 마이크로리터당 50마이크로그램의 웰당 1밀리리터를 사용하여 실온에서 최소 2시간 동안 6웰 플레이트를 코팅합니다. 6웰 플레이트에서 폴리-D-라이신을 흡인하고 수직 클린 벤치에서 약 10분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 이전에 희석한 밀리리터당 5마이크로그램의 라미닌을 웰당 1밀리리터를 6웰 플레이트에 첨가하고 섭씨 37도에서 4-6시간 동안 배양하여 코팅합니다. 사용하기 전에 플레이트를 D-PBS로 세척하십시오.

3일째에, 모든 센다이 바이러스 형질도입된 MNC를 유도된 신경 줄기 세포 배지에 폴리-D-라이신 라미닌 코팅 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 5일과 7일에 섭씨 37도에서 예열된 iNSC 배지 1밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 부드럽게 첨가합니다.

9일차부터 28일차까지 매일 배지를 예열된 신선한 iNSC 배지로 교체하십시오. iNSC 콜로니의 출현을 모니터링하고 약 2-3주 후에 연소된 유리 피펫을 사용하여 적절한 형태를 가진 콜로니를 선택합니다. 그런 다음 확장을 위해 각 콜로니를 6웰 플레이트의 별도 웰로 옮깁니다.