MSC Seeded Scaffold Preparation: 쥐 모델에 외과적 이식을 위해 중간엽 줄기세포로 파종된 골격을 준비하는 기술

암세포는 중간엽 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포를 혈관에서 종양 위치로 끌어당기기 위해 화학주성 귀소 인자를 생성합니다.

시험관 내에서 종양 성장에 대한 이러한 세포의 효과를 연구하려면 멸균된 스캐폴드 기질을 취하는 것부터 시작하십시오. 스캐폴드를 미리 적시기 위해 원하는 배지가 들어 있는 웰 플레이트로 옮깁니다. 더 나은 세포 접착을 위해 스캐폴드에 달라붙는 과도한 배지를 제거하기 위해 건조한 표면에 놓으십시오. 부분적으로 건조된 비계를 새 우물로 옮깁니다. 비계에 MSC 현탁액 한 방울을 뿌립니다.

또한 웰 모서리에 더 많은 배지를 추가하여 후속 배양 중에 방울로 인한 배지 증발을 방지하는 수화 챔버를 만듭니다. MSC가 스캐폴드 표면에 부착될 수 있도록 배양합니다. 비계를 뒤집어 시드가 없는 표면을 노출시킵니다. 이쪽에 MSC 현탁액을 새로 떨어뜨리고 MSC가 부착되도록 합니다.

MSC가 스캐폴드의 양쪽에 부착된 후, 모든 세포가 배지와 접촉하도록 더 많은 배지로 덮습니다. MSC가 성장하고 스캐폴드의 틈새와 기공 내에 침투할 때까지 배양합니다. MSC 시드 스캐폴드는 외과적 이식이 가능합니다.

PLA 스캐폴드를 약 2 x 2mm의 절제 공동 크기 조각으로 절단하여 마우스에 이식하기 48시간 전에 스캐폴드를 준비합니다. 70% 에탄올에 15분 동안 담가 스캐폴드를 멸균합니다. 15분 후 스캐폴드를 PBS에 담그십시오. 그런 다음 파종을 위해 세포를 준비하는 동안 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium에 스캐폴드를 놓습니다.

세포를 준비하려면 먼저 0.05% 트립신을 사용하여 배양된 MSC를 들어 올립니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후 세포가 들어 올랐는지 확인하십시오. 그런 다음 플라스크에 DMEM을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 그런 다음 플라스크 내용물을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 100 x g에서 5분 동안 원심분리를 통해 각 스캐폴드에 대해 5회 10 내지 다섯 번째 MSC를 펠릿

원심분리 후, 상층액을 흡인하고 MSC를 5배 10당 5마이크로리터의 DMEM에 다섯 번째 세포에 재현탁합니다. 그런 다음 집게로 DMEM 침지에서 스캐폴드를 제거하고 6웰 플레이트의 뚜껑 위에 놓습니다. 뚜껑에서 비계를 들어 올려 과도한 DMEM 방울을 남깁니다. 비계를 다시 뚜껑에 올려 놓고 건조한 새 위치에 놓습니다. 3-5회 반복합니다. 그런 다음 파종을 위해 부분적으로 건조된 비계를 새 6웰 플레이트에 놓습니다.

부분적으로 건조된 스캐폴드는 최적의 세포 파종 결과를 제공합니다. 스캐폴드가 너무 젖으면 세포가 스캐폴드에서 미끄러져 아래 플레이트에 부착됩니다. 스캐폴드가 건조되면 비말이 스캐폴드 전체에 퍼지지 않아 초기 세포 분포가 불량해집니다.

피펫을 사용하여 일부 세포가 바닥에 침전되었을 수 있으므로 MSC 튜브를 부드럽게 혼합하여 현탁액을 균질화합니다. 2.5마이크로리터의 새로 혼합된 MSC 현탁액을 스캐폴드에 직접 천천히 피펫팅하여 스캐폴드 위에 작은 물방울을 만듭니다. 세포 액적의 급격한 증발을 방지하기 위해 각 웰의 가장자리에 300마이크로리터의 DMEM을 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 세포가 스캐폴드에 부착되도록 합니다.

배양 후 집게를 사용하여 웰 플레이트에서 스캐폴드를 부드럽게 뒤집습니다. 2.5마이크로리터의 새로 혼합된 MSC 현탁액을 시드하여 스캐폴드당 시딩된 다섯 번째 세포에 총 5회 10배를 제공합니다. 세포가 스캐폴드에 부착될 수 있도록 30분 동안 배양한 후, 6웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터를 추가하여 DMEM으로 스캐폴드를 덮습니다. 비계를 부드럽게 들어 올려 미디어가 그 아래로 흐르도록 합니다. 이식 수술 전 48시간 동안 이 상태에서 섭씨 37도에서 배양합니다.