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암 연구
0 조회수 • 4:15 분 • July 8th, 2025
뇌종양 줄기세포(BTSC)는 뇌종양 세포 하위 집단인 종양 성장과 전이를 시작할 수 있어 암 치료의 유망한 표적이 됩니다. 시험관 내에서 BTSC 이동에 대한 약물의 효과를 연구하기 위해 먼저 적절한 배지에서 BTSC의 균일한 현탁액을 준비합니다. 현탁액 중 하나를 관심 약물로 치료하십시오.
한편, 각 웰을 상부 및 하부 챔버로 분리하는 막 삽입물로 구성된 다중 웰 화학주성 플레이트를 얻습니다. 원하는 세포외 기질 단백질을 하부 챔버와 막 삽입물로 피펫팅했습니다. 단백질의 중합을 촉진하기 위해 배양합니다.
원하는 화학유인제를 포함하는 적절한 기저 배지를 하부 챔버에 추가하고 막 삽입물 위에 놓습니다. 다음으로, 약물 처리 및 미처리 BTSC 현탁액을 막 삽입물에 시드합니다. 살아있는 세포 현미경을 사용하여 장기간 플레이트를 이미지
화합니다.배양에서 BTSC는 삽입물의 단백질 매트릭스에 부착됩니다. 상부 챔버와 하부 챔버 사이에 설정된 화학유인 농도 구배에 반응하여 처리되지 않은 BTSC는 멤브레인 삽입 기공을 통해 단백질 매트릭스를 가로질러 하부 챔버로 이동합니다.
그러나 약물 치료는 세포의 기능적 활동에 부정적인 영향을 미쳐 BTSC 이동을 감소시킵니다. 이제 적절한 소프트웨어를 사용하여 하부 챔버에서 마이그레이션된 BTSC를 분석하고 정량화합니다. 처리되지 않은 BTSC는 이동이 증가한 반면, 약물 처리된 BTSC는 이동이 감소한 것으로 나타났습니다.
관심 있는 약물 치료가 이동에 미치는 영향을 평가하려면 먼저 적절한 실험 기간 동안 적절한 농도의 약물로 세포를 전처리합니다. 화학주성 플레이트를 준비하기 위해서는, 섭씨 37도에서 1시간 동안 각각 75마이크로리터와 225마이크로리터의 밀리리터당 0.2밀리그램의 I형 콜라겐으로 96웰 화학주성 플레이트의 조건에 따라 3개의 멤브레인 삽입 웰과 3개의 바닥 저장소 웰을 코팅합니다.
배양이 끝나면 콜라겐 코팅을 긁지 않고 각 웰에서 콜라겐 용액을 흡인하고 멸균 PBS로 웰을 두 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 플레이트에서 인서트를 제거하고 10% FBS가 보충된 225마이크로리터의 성장 인자 없는 배지를 화학주성 플레이트의 각 하단 저장소 웰에 추가합니다.
그런 다음 기포가 생성되지 않도록 상단 인서트를 비스듬히 하단 저장소로 부드럽게 되돌리고 성장 인자가 없는 배지 50마이크로리터에 있는 세 번째 해리된 BTSC에 2.5 x 10을 각 인서트 웰에 추가합니다. BTSC를 단일 세포로 완전히 해리하고 세포 덩어리가 있거나 상단 삽입물에 너무 많은 세포가 생기지 않도록 도금 전에 주의 깊게 계산하는 것이 중요합니다.
FBS 구배를 따라 BTSC 이동을 이미지화하려면 플레이트를 살아있는 세포 이미징 시스템에 넣고 최대 72시간 동안 1-2시간마다 플레이트의 현미경 이미지를 획득하도록 자동 이미징 소프트웨어를 설정합니다. 이미지 획득이 완료되면 새로운 처리 정의를 선택하여 막 하단의 삽입 기공에서 BTSC를 구별하고, 필요에 따라 배경 막에서 세포를 정확하게 구별하지 못하는 경우 분석을 수정합니다.
기공을 통해 이동한 세포를 정량화하려면 조건당 3개의 복제 웰 각각에 대해 멤브레인 바닥의 세포 표면적으로 데이터를 수집합니다. 그런 다음 시간이 지남에 따라 마이크로미터의 제곱으로 이동한 세포 영역으로 세포 이동을 그래프로 표시합니다.