1차 뇌 주피세포의 분리 및 배양: 내피 세포 오염 없이 소 뇌 모세 세포에서 주피 세포를 분리하고 배양하는 절차

0 조회수4:21 • July 8th, 2025

중추신경계에서 주위 세포는 모세혈관의 내부 세포 내벽을 형성하는 내피 세포를 감싸는 다기능 세포입니다. 주위 세포는 혈류를 조절하고 뇌 항상성을 유지하는 데 도움이 됩니다.

주위 세포를 분리하려면 먼저 냉동 소 뇌 모세혈관을 바이알에 담아 복용하십시오. 해동 후 내용물을 원하는 배지가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 원심분리하여 모세혈관을 펠릿화합니다. 동결 배지 함유 상청액을 제거합니다. 모세관 펠릿을 배지에 재현탁하고 현탁액을 세포외 기질 단백질 코팅 플라스크에 시드합니다.

모세관이 플라스크의 코팅에 부착되도록 배양합니다. 배지를 헤파린 함유 배지로 교체하십시오. 배양에서 세포외 기질 단백질 코팅은 주위 세포가 모세혈관 단편에서 멀어지고 증식하도록 촉진하는 반면, 헤파린은 내피 세포 이동을 자극합니다.

사용한 배지를 헤파린 함유 배지로 교체하십시오. 시간이 지남에 따라 주위 세포는 플라스크에 강하게 부착되는 길쭉한 과정을 투사합니다. 제한된 기질 공간으로 내피 세포는 증식하여 접촉 억제 단층을 형성합니다. 적절한 주위 세포 밀도에 도달하면 배지를 제거하고 플라스크를 완충액으로 세척합니다.

트립신-EDTA를 사용하여 플라스크에서 느슨하게 결합된 내피 세포를 분리합니다. 그 후, 트립신-EDTA 활성을 중화하기 위해 배지를 추가합니다. 배지로 반복적으로 세척하여 분리된 내피 세포를 제거합니다. 배지를 추가하고 주위 세포가 플라스크에 부착된 상태로 유지되도록 합니다. 주위 세포가 풍부한 배양액을 배양하여 증식시킵니다.

먼저 섭씨 37도의 수조에서 모세혈관 한 바이알을 해동합니다. 모세혈관이 해동되면 30밀리리터의 DMEM-comp가 담긴 원심분리기 튜브로 옮기고 500 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 튜브에서 배지를 제거하고 펠릿을 10밀리리터의 신선한 DMEM-comp에 재현탁합니다. 현탁액을 코팅된 T75 플라스크로 옮기고 10% 이산화탄소가 공급되는 섭씨 37도 인큐베이터에서 모세관이 바닥에 4-6시간 동안 부착되도록 합니다. 배양 후 광학 현미경으로 플라스크를 검사합니다.

이제 모세관의 일부가 플라스크 바닥에 부착되어야 합니다. 4일째에 모세혈관을 파종한 후 현미경으로 검사하여 약 60%에서 70%가 합류하는지 확인합니다. 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 부드럽게 세척합니다. 해동된 트립신-EDTA 2밀리리터를 넣고 플라스크를 인큐베이터에 1-3분 동안 방치한 후 플라스크를 자주 꺼내 현미경으로 세포 박리를 관찰합니다. 내피 세포가 둥글기 시작하면 플라스크를 가볍게 두드려 분리합니다.

세포가 분리되면 플라스크에 10밀리리터의 DMEM-comp를 추가하여 트립신화를 중지합니다. 플라스크를 배지로 몇 번 세척하고 내피 세포 현탁액을 흡인하면 이제 다른 목적으로 사용할 수 있습니다. 플라스크에 10밀리리터의 DMEM-comp를 넣고 광학 현미경으로 확인하여 주위 세포가 여전히 존재하고 바닥에 부착되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 플라스크를 인큐베이터에 다시 넣어 주위 세포가 풍부한 배양물이 성장할 수 있도록 합니다.

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마지막 업데이트: 29 8월 2026