인간 뇌에서 대뇌 모세혈관 분리: 인간 뇌 조직에서 대뇌 모세혈관을 추출하는 최적화된 방법

대뇌 모세혈관은 혈액과 뇌 사이에서 용질의 선택적 이동을 가능하게 하는 반투과성 장벽인 혈액-뇌 장벽의 중요한 구성 요소입니다. 대뇌 모세혈관을 분리하려면 신선한 인간 뇌 조직부터 시작하십시오. 수막을 제거하고 백질을 잘라냅니다.

뇌 조직을 더 작은 조각으로 다집니다. 조각을 적절한 완충액이 포함된 균질화기로 옮기고 균질화합니다. 균질화는 조직을 분해하여 모세혈관과 조직 파편을 용액으로 방출합니다.

균질액을 새 튜브로 옮기고 적절한 밀도 구배 배지의 최적 부피를 추가합니다. 용액을 원심분리하여 모세혈관을 펠릿화합니다. 밀도 구배 매체가 너무 많거나 너무 적으면 모세관 수율이 낮아집니다. 상청액을 제거합니다.

소 혈청 알부민 또는 BSA 보충 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. BSA는 소화 효소를 안정화시키고 모세혈관의 구조적 무결성을 유지합니다. 그런 다음 적절한 필터로 용액을 여과하여 큰 혈관과 조직 파편을 제거합니다.

그런 다음 여과액을 더 작은 메쉬 필터에 통과시킵니다. 이 필터는 대뇌 모세혈관을 유지하고 더 작은 파편과 적혈구가 통과할 수 있도록 합니다. 그런 다음 필터를 뒤집고 BSA가 보충된 완충액이 있는 새 튜브에서 모세관을 씻어냅니다.

용액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 순수한 모세혈관을 완충액에 재현탁하고 추가 사용을 위해 보관합니다.

이 절차를 시작하려면 약 10g이어야 하는 인간 뇌 조직의 무게를 문서화하십시오. 현미경으로 집게로 모든 수막을 조심스럽게 제거하고 메스를 사용하여 백질을 잘라냅니다. 그런 다음 뇌 조직을 조심스럽게 잘라 메스로 약 5분 동안 다집니다.

뇌 조직을 조직 분쇄기로 옮기고 30밀리리터의 분리 완충액을 추가합니다. 그런 다음 50rpm에서 100스트로크로 각 샘플을 균질화합니다. 기포를 방지하기 위해 공기 중에서 저어주지 마십시오. 25스트로크마다 시간과 100스트로크에 필요한 총 시간을 문서화합니다. 그런 다음 균질화를 얼음 위의 Dounce 균질화기로 옮깁니다. 약 20스트로크 동안 현탁액을 균질화하고 기포를 피하십시오.

그런 다음 뇌 균질액을 4개의 50밀리리터 원심분리 튜브에 균등하게 분배하고 균질액의 총 부피를 문서화합니다. Ficoll의 올바른 볼륨을 추가했는지 확인하십시오. Ficoll이 너무 적거나 너무 많으면 모세관을 세포 파편에서 분리하는 데 잘못된 밀도가 발생하여 모세관 펠릿이 감소하고 수율이 제한됩니다.

10밀리리터의 분리 완충액을 사용하여 유봉