0 조회수 • 5:19 분 • July 8th, 2025
누운 자세로 놓인 임신한 마취된 암컷 마우스 모델을 취하는 것으로 시작합니다. 복부에서 털을 제거하여 마우스를 준비합니다. 피부와 그 밑에 있는 근육층을 절개하여 생존 가능한 배아를 수용하는 부위인 자궁 뿔을 노출시킵니다.
이제 자궁 뿔을 복강 밖으로 빼냅니다. 원하는 플라스미드 DNA 용액이 들어 있는 날카로운 팁 유리 모세관을 가져 와십시오. 배아의 뇌를 찾아 플라스미드 DNA 용액을 자궁벽을 통해 제4뇌실로 주입합니다. 이 위치는 최종 DNA 전달을 위해 원하는 위치인 소뇌 원기의 앞쪽에 있습니다.
주사 후 빈 모세혈관을 집어넣습니다. 다음으로, DNA 주입 배아의 전기천공을 위해 양극이 소뇌 원초를 덮고 음극이 귀 주변 영역을 덮도록 두 전극을 자궁벽 위에 배치합니다.
원하는 시간 동안 전기 펄스를 적용합니다. 이러한 펄스는 소뇌 신경 세포를 투과성 있게 만들어 플라스미드 DNA가 표적 세포에 들어갈 수 있도록 합니다. 마지막으로 자궁 뿔을 복강 내부의 자연스러운 위치로 다시 놓습니다. 상처를 봉합하고 마우스를 케이지로 옮긴 다음 회복되도록 합니다.
붕규산 유리 모세관을 마이크로피펫 풀러에 넣고 당겨 미세한 팁을 만드는 것부터 시작합니다. 주입 중 더 나은 시각화를 위해 모세관 팁에 검은색 잉크로 라벨을 붙이고 유리에 스케일을 그립니다. 실체 현미경으로 작업하면서 눈금자와 날카로운 바늘 핀셋을 사용하여 팁을 약 6mm 길이로 자르고 날카롭고 한쪽 경사진 가장자리를 만듭니다.
0.22미크론 필터를 통해 1% Fast Green 원액을 여과하여 용액에서 염료 입자를 제거합니다. 단일 가이드 RNA 플라스미드를 루시페라아제 리포터 플라스미드와 동일한 비율로 각 플라스미드에 대해 밀리리터당 최소 1마이크로그램의 최종 농도로 혼합합니다.
최종농도 0.05%의 Fast Green으로 혈장 용액을 착색합니다. 임신한 CD-1 마우스를 이소플루란으로 마취한 후, 마우스를 가열 패드 위에 등을 대고 진통제를 투여합니다. 수술 중 안구건조증을 예방하기 위해 안구연고를 바르십시오. 팔다리를 테이프로 고정하고 소독제로 복부를 소독하십시오.
마우스를 거즈로 덮고 수술 부위만 노출시킵니다. 약 2cm 길이의 피부 절개를 한 후 백선의 위치를 찾아 뭉툭한 끝 조직 가위를 사용하여 복막을 통해 약간 작은 두 번째 절개를 합니다. 열린 복강을 예열된 멸균 PBS로 적십니다.
다음으로, 링 겸자를 사용하여 복강에서 자궁 뿔을 조심스럽게 추출합니다. 인접한 두 배아의 난황낭 사이의 틈에서 자궁벽을 잡고 부드럽게 당깁니다. 절개 부위를 통해 배아를 당기는 동안 배아에 압력이 가해지지 않도록 하십시오. 자궁 뿔이 추출되면 준비된 유리 모세관으로 약 10-15마이크로리터의 유색 플라스미드 용액을 흡인합니다. 이 과정에서 기포가 생기지 않도록 하십시오.
링 겸자로 배아를 부드럽게 잡고 목 부위를 찾습니다. 유리 모세혈관의 끝으로 등쪽 후뇌를 천천히 관통하여 제4뇌실로 이동합니다. 약 1마이크로리터의 플라스미드 믹스를 주입합니다. 염색된 DNA가 뇌에서 새어 나오지 않고 다이아몬드 모양의 구조로 보이는지 확인합니다.
여기서 DNA를소뇌 원기의 원위 부분에도 전달하기 위해 제4뇌실의 전체 영역을 플라스미드 용액으로 채우는 것이 가장 중요합니다. 동시에 그 과정에서 출혈을 일으키지 않도록 주의하십시오.
직경5mm의 전극판이 장착된 백금 핀셋을 배아 머리 위에 측면으로 배치하고 음극은 귀를 덮고 양극은 자궁벽 위의 소뇌 원기에 위치하고 전기 사각 펄스를 가합니다.
모든 배아가 전기천공되면 자궁 뿔을 복강에 다시 조심스럽게 넣고 멸균 PBS로 채웁니다. 자궁 뿔이 자연스러운 위치로 미끄러지도록 하십시오. 마취를 끄고 동물의 배를 새 케이지에 넣어 회복하십시오.