자궁 전기천공법 기반 유전자 전달: 쥐 배아의 배아 소뇌 세포에 플라스미드 DNA를 주입하는 기술

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누운 자세로 놓인 임신한 마취된 암컷 마우스 모델을 취하는 것으로 시작합니다. 복부에서 털을 제거하여 마우스를 준비합니다. 피부와 그 밑에 있는 근육층을 절개하여 생존 가능한 배아를 수용하는 부위인 자궁 뿔을 노출시킵니다.

이제 자궁 뿔을 복강 밖으로 빼냅니다. 원하는 플라스미드 DNA 용액이 들어 있는 날카로운 팁 유리 모세관을 가져 와십시오. 배아의 뇌를 찾아 플라스미드 DNA 용액을 자궁벽을 통해 제4뇌실로 주입합니다. 이 위치는 최종 DNA 전달을 위해 원하는 위치인 소뇌 원기의 앞쪽에 있습니다.

주사 후 빈 모세혈관을 집어넣습니다. 다음으로, DNA 주입 배아의 전기천공을 위해 양극이 소뇌 원초를 덮고 음극이 귀 주변 영역을 덮도록 두 전극을 자궁벽 위에 배치합니다.

원하는 시간 동안 전기 펄스를 적용합니다. 이러한 펄스는 소뇌 신경 세포를 투과성 있게 만들어 플라스미드 DNA가 표적 세포에 들어갈 수 있도록 합니다. 마지막으로 자궁 뿔을 복강 내부의 자연스러운 위치로 다시 놓습니다. 상처를 봉합하고 마우스를 케이지로 옮긴 다음 회복되도록 합니다.

붕규산 유리 모세관을 마이크로피펫 풀러에 넣고 당겨 미세한 팁을 만드는 것부터 시작합니다. 주입 중 더 나은 시각화를 위해 모세관 팁에 검은색 잉크로 라벨을 붙이고 유리에 스케일을 그립니다. 실체 현미경으로 작업하면서 눈금자와 날카로운 바늘 핀셋을 사용하여 팁을 약 6mm 길이로 자르고 날카롭고 한쪽 경사진 가장자리를 만듭니다.

0.22미크론 필터를 통해 1% Fast Green 원액을 여과하여 용액에서 염료 입자를 제거합니다. 단일 가이드 RNA 플라스미드를 루시페라아제 리포터 플라스미드와 동일한 비율로 각 플라스미드에 대해 밀리리터당 최소 1마이크로그램의 최종 농도로 혼합합니다.

최종

농도 0.05%의 Fast Green으로 혈장 용액을 착색합니다. 임신한 CD-1 마우스를 이소플루란으로 마취한 후, 마우스를 가열 패드 위에 등을 대고 진통제를 투여합니다. 수술 중 안구건조증을 예방하기 위해 안구연고를 바르십시오. 팔다리를 테이프로 고정하고 소독제로 복부를 소독하십시오.

마우스를 거즈로 덮고 수술 부위만 노출시킵니다. 약 2cm 길이의 피부 절개를 한 후 백선의 위치를 찾아 뭉툭한 끝 조직 가위를 사용하여 복막을 통해 약간 작은 두 번째 절개를 합니다. 열린 복강을 예열된 멸균 PBS로 적십니다.

다음으로, 링 겸자를 사용하여 복강에서 자궁 뿔을 조