SB 매개 전치를 사용한 교모세포종 유도: 신생아 마우스 뇌에 SB 플라스미드의 전이(Transposon) 매개 통합을 사용하여 새로운 마우스 모델을 생성하는 기술

플라스미드 혼합물이 들어 있는 튜브를 가져가는 것으로 시작합니다. 잠자는 숲속의 미녀 또는 SB 트랜스포존 플라스미드는 두 개의 거꾸로 된 반복 서열 사이에 끼워진 인간 유래 교모세포종 유도 종양유전자를 포함하는 전위 요소를 운반하도록 설계되었습니다. 또한, 이 혼합물은 전위 효소 발현 요소를 갖는 SB 전위 효소 플라스미드를 포함합니다.

이제 튜브에 적절한 형질감염 시약을 추가합니다. 주사 혼합물을 마이크로 바늘이 장착된 주사기에 흡인합니다. 다음으로, 마취된 쥐 강아지를 정위 고정 프레임에 엎드린 자세로 고정합니다. 강아지의 머리 부위를 시각화하여 두개골 봉합사를 찾습니다. 두개골 봉합사 위에 마이크로니들을 배치합니다.

혼합물을 뇌 실질 내의 공동인 측심실에 주입합니다. 그 후, 용액은 뇌 실질로 분산되어 형질감염 시약 분자가 세포 내 플라스미드의 진입을 촉진합니다. 세포 내부로 들어가면 트랜스포자제 플라스미드는 역된 반복 서열을 인식하고 트랜스포존 요소를 절제하는 트랜스포자제 효소 분자를 발현합니다.

그런 다음 전위 요소 DNA는 강아지 게놈 DNA의 TA 반복 영역에 재통합됩니다. 유전적 전위는 뇌 세포의 발암성 변형을 초래하여 마우스 뇌에서 교모세포종의 발달로 이어집니다.

실험 3-4주 전에 수컷 1마리와 암컷 1마리가 있는 마우스 사육 케이지를 설치합니다. 환경을 풍요롭게 하고 짝짓기 가능성을 높이기 위해 유색 플라스틱 이글루를 포함하세요. 임신이 확인되면 수컷을 제거하고 짝짓기일 후 18일 후에 분만을 위해 암컷을 모니터링하기 시작합니다. 출산 전후로 대리모가 있는지 확인하십시오.

출생 후 첫날에 뇌실내 주사를 시행합니다. 먼저 트랜스포존 플라스미드를 포함하는 DNA 믹스 20마이크로리터를 마이크로리터당 0.5마이크로그램의 DNA의 최종 농도로 분취하여 주사 용액을 준비합니다. 다음으로, 20마이크로리터의 PEI 용액을 DNA 용액에 첨가하고 실온에서 20분에서 1시간 동안 배양한 후 혼합물을 얼음 위에 보관해야 합니다.

주사 바늘의 경우 10도 각도로 경사진 30게이지 피하 주사 바늘에 12.5마이크로리터 주사기를 부착합니다. 그런 다음 자동 주입이 있는 펌프에 주사기를 부착합니다. 10마이크로리터의 물로 설정을 테스트하고 주사기를 비워야 합니다. 이제 드라이아이스와 알코올 슬러리로 신생아 정위 단계를 식히십시오. 섭씨 2도에서 8도 사이로 냉각되면 주사를 진행합니다.

강아지를 얼음 위에 2분 동안 놓아 마취합니다. 강아지가 얼음 위에 있는 동안 주사기에 주사 용액을 넣으십시오. 마취가 완료되면 강아지를 프레임으로 옮기고 거즈로 덮인 이어 바 사이에 머리를 고정합니다. 두개골의 등쪽이 수평이고 프레임 표면과 평행한지 확인하십시오. 또한 두개골 봉합사가 명확하게 보여야 합니다.

강아지의 머리가 충분히 단단히 고정되지 않으면 주사 중에 움직이고, 프레임의 이어바 사이에 너무 세게 눌리면 람다가 보이지 않고 머리 내부의 압력으로 인해 주입된 용액이 새어 나옵니다.

강아지를 프레임에 단단히 잡은 상태에서 70% 에탄올로 머리를 닦아냅니다. 그런 다음 바늘을 내리고 람다에 닿도록 위치를 조정합니다. 그런 다음 바늘을 들어 옆으로 0.8mm, 주둥이로 1.5mm 움직입니다. 그런 다음 피부가 약간 움푹 들어갈 때까지 다시 내립니다. 이 위치의 좌표를 기록합니다. 그런 다음 바늘을 피부와 두개골을 통해 측심실의 피질로 1.5mm 내립니다.

거기에서 0.75초에 걸쳐 90마이크로리터를 주입하고 용액이 분산될 때까지 잠시 기다립니다. 기다리는 동안 주사를 맞을 다음 강아지는 마취를 할 수 있습니다. 기다린 후 천천히 바늘을 들어 올리십시오. 그런 다음 강아지를 가열 램프 아래의 회복 위치로 옮깁니다. 마취에서 가온까지의 시간은 10분 미만이어야 합니다. 빠를수록 좋습니다.

호흡을 모니터링하고 필요한 경우 팔다리를 부드럽게 문질러 호흡을 자극합니다. 강아지가 따뜻해지고 장밋빛 색과 꾸준한 호흡을 갖게 되면 어미에게 돌려주세요.