쥐 뇌 혈관 분리: 쥐 뇌 샘플에서 온전한 혈관을 분리하는 프로토콜

뇌 혈관은 촘촘하게 연결된 내피 세포층으로 둘러싸여 있습니다. 이 세포는 주위 세포 및 성상세포와 같은 세포 구성 요소와 함께 주변에 기저막을 가지고 있습니다.

주변 뉴런과 신경교세포로부터 뇌혈관을 분리하려면 균질화 완충액에 잠긴 마우스 뇌가 들어 있는 비커를 가져갑니다. 작은 조각으로 다져주세요. 뇌 조직을 균질화하여 해리시켜 뉴런, 신경교세포, 뇌혈관을 방출합니다. 이 치료는 또한 뉴런을 둘러싼 수초를 파괴합니다.

균질을 튜브로 옮기고 원심분리하여 용기를 펠릿화합니다. 뉴런 및 신경교세포와 같은 가벼운 성분은 상청액에 남아 있는 반면 미엘린은 펠릿을 둘러싸고 조밀한 계면층을 형성합니다.

상청액을 버리고 부착된 미엘린 층이 있는 혈관 펠릿을 적절한 밀도 구배 배지에 재현탁합니다. 원심분리하여 혈관을 펠릿화하고 상청액 상단에 떠 있는 지방이 풍부한 미엘린 밴드를 얻습니다. 사용한 배지와 함께 미엘린 밴드를 제거하고 펠릿을 새로운 완충액에 재현탁합니다.

용기가 통과할 수 없을 정도로 작은 필터가 포함된 필터 어셈블리를 사용하여 원유 용기 준비를 변형시킵니다. 필터를 완충 용액이 들어 있는 새 비커에 옮깁니다. 여과지를 부드럽게 긁어 용기를 분리하고 추가 분석을 위해 보관하십시오.

메스를 사용하여 쥐의 목에서 코까지 피부를 절개하고 피부를 뒤로 당깁니다. PBS로 두개골을 씻어 오염된 털을 제거한 다음 후각 구근 앞쪽의 두개골에 가위를 삽입합니다. 가위를 열어 두개골을 두 부분으로 파열하고 주걱으로 뇌를 제거합니다.

다음으로, 측뇌실에서 맥락막 신경총을 해부하고 뇌를 얼음 위에 20밀리리터의 B1 용액이 들어 있는 150밀리리터 비커로 옮깁니다. 그런 다음 두 개의 메스를 사용하여 뇌를 2mm 조직의 조각으로 세게 자르고 자동 Dounce 균질화기를 사용하여 얼음 위에서 400rpm에서 20회 스트로크 동안 조직을 균질화합니다.

용기를 정제하려면 균질수를 50밀리리터 플라스틱 튜브로 옮기고 스윙 로터 원심분리기에서 조직 슬러리를 회전시킵니다. 대부분 미엘린으로 구성된 큰 흰색 계면이 혈관 펠릿 상단에 형성됩니다. 상청액을 버리십시오.

얼음처럼 차가운 B2 용액 20ml를 넣고 튜브를 1분 동안 세게 흔듭니다. 두 번째 원심분리 후 미엘린은 상청액 표면에 조밀한 흰색 층을 형성합니다. 튜브를 천천히 돌려 B2 용액이 쏟아질 때 벽을 따라 흐르도록 하고 상청액과 함께 미엘린을 버립니다.

그런 다음 흡수지로 싸인 플라스