JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 4:21 분 • July 8th, 2025
소뇌 과립 세포는 뇌에서 가장 풍부한 유형의 뉴런입니다. 외부 입상층인 EGL은 입상 세포 전구체인 GCP로만 구성되며, 이 전구체는 분화하고 내부로 이동하여 내부 입상층인 IGL을 형성합니다.
입상 세포 발달을 시각화하려면 페트리 접시의 바닥에 양극을 부착하여 전기천공 챔버를 준비합니다. 전극을 덮기 위해 배양 배지를 추가합니다. 이제 배지로 덮인 전극에 배양 삽입물을 놓습니다. 병아리 배아 소뇌 조각을 시상 방향으로 배양 인서트에 옮깁니다.
시상면을 통해 표적층-EGL을 다른 소뇌층에 대해 식별할 수 있습니다. EGL 위에 GFP 플라스미드 DNA를 포함하는 점성 염료 용액을 추가합니다. GFP 플라스미드 DNA는 세포 세포질 내에서 균질하게 분포하고 살아있는 세포 이미징을 가능하게 하는 녹색 형광 단백질을 암호화합니다.
다음으로, EGL 근처의 배지에 음극을 놓되 조직에 직접 놓지 마십시오. 그런 다음 서로 다른 EGL 영역에 여러 전기 펄스를 적용합니다. 전기 펄스는 세포막에 일시적인 기공을 유도하여 세포가 플라스미드 DNA를 흡수할 수 있도록 합니다. 그 후, 플라스미드 DNA는 과립 세포에서 GFP 발현을 가능하게 합니다.
형광 현미경으로 소뇌 절편을 이미지화하여 세포 발달의 여러 단계에서 입상 세포 분화 및 이동 패턴을 관찰합니다.
절연 테이프를 사용하여 전기천공기의 양극을 60mm 페트리 접시의 바닥에 고정하여 전기천공 챔버를 구성합니다. 전극을 덮기 위해 약 1밀리리터의 HBSS를 추가합니다. 다음으로, HBSS로 덮인 전극 위에 0.4마이크로미터 배양 인서트를 놓습니다.
절단 팁이 있는 3밀리리터 파스퇴르 피펫을 사용하여 식별된 슬라이스를 인서트당 최대 5개까지 배양 인서트에 옮깁니다. 그런 다음 슬라이스를 분리하고 시상 방향으로 배양 인서트에 가라앉히도록 합니다. 피펫을 사용하여 뇌 조각에서 과도한 배지를 제거합니다. 인서트와 전극 사이에 접촉이 있도록 인서트를 전극 위에 놓습니다.
이 설정에서 슬라이스가 있는 배양 삽입물은 배지 표면에 놓여 회로를 유지하지만 음극의 공간적 타겟팅을 허용합니다. P10 피펫 팁을 사용하여 각 슬라이스의 표적 영역 표면에 20% Fast Green으로 희석된 5마이크로리터의 DNA를 피펫팅합니다. Fast Green을 첨가하면 DNA 용액이 DNA의 광범위한 분산을 방지할 만큼 점성이 있습니다.
그런 다음 원하는 표적 조직 위에 음극을 놓고 샘플을 전기 천공합니다. 음극을 실제로 만지지 않고 가능한 한 조직에 가깝게 배치하여 음극이 조직과 직접 접촉하지 않도록 하십시오. 원하는 대로 각 개별 소뇌 절편의 외부 과립층의 여러 영역에서 전기천공을 반복합니다.
완료되면 배양 삽입물을 30mm 페트리 접시로 옮깁니다. 각 배양액에 배양 삽입물 아래에 예열된 배양 배지 1밀리리터를 추가합니다. 인서트가 매체에 뜨지 않도록 하십시오. 배양 삽입물은 배지와 접촉해야 하지만 슬라이스는 배지에 담그지 않아야 합니다.