Organotypic Brain Slice Cultures의 Single Cell Electroporation: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices(유기형 뇌 슬라이스 배양에서의 단세포 전기천공법: 뇌 해마 슬라이스의 표적 뉴런 내부에 플라스미드를 전달하는 체외 기술)

원하는 플라스미드 용액이 들어 있는 유리 피펫을 가져와 전기천공을 시작합니다. 은선 전극이 장착된 마이크로피펫 홀더에 부착하여 전극이 마이크로피펫에 삽입되도록 합니다. 인공 뇌척수액에 잠긴 초박형 해마 절편이 포함된 전기천공 챔버를 가져 가십시오.

후속 전기천공을 위해 접지 전극을 챔버에 존재하는 유체에 담그십시오. 피펫 팁을 전기천공 챔버로 내리고 기준선 저항을 기록합니다. 현미경을 사용하여 피펫 팁을 표적 세포 근처에 배치합니다. 피펫이 신경막과 접촉하면 저항이 급격히 증가합니다.

양압을 가하여 신경막에 작은 함입을 만듭니다. 빠르게 가벼운 흡입을 가하여 멤브레인을 위로 밀어 피펫 팁과 멤브레인 사이에 느슨한 밀봉을 만듭니다. 이 과정을 몇 번 더 반복하여 막을 조절하고 세포 용해를 방지합니다.

컨디셔닝 후 강한 흡입력을 가하여 기가옴 씰이라는 멤브레인으로 단단히 밀봉합니다. 전기 펄스를 사용하여 멤브레인의 밀봉된 영역에 일시적인 기공을 형성합니다. 이러한 개구부는 표적 뉴런 내부에 플라스미드가 들어가는 것을 촉진합니다. 전기천공 후 기공이 다시 밀봉되어 뉴런 내부에 플라스미드를 가둡니다.

전기천공을 위한 슬라이스 배양을 준비하려면 관심 배양 삽입물을 900마이크로리터의 배양 배지가 장착된 개별 3cm 페트리 접시로 옮기고 배양액을 탁상용 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 다음으로, 신선한 배양 인서트를 3.5cm 페트리 접시에서 인서트당 1밀리리터의 슬라이스 배양 배지와 함께 최소 30분 동안 사전 배양하고 10% 표백제로 전기천공 장비의 라인을 5분 동안 멸균합니다.

관류가 끝나면 0.001밀리몰 테트로도톡신을 함유한 필터 멸균 aCSF로 관류하기 전에 이온화된 고압멸균수로 최소 30분 동안 라인을 헹굽니다. 전기천공기 펄스를 마이너스 5볼트의 진폭, 정사각형 펄스, 500밀리초의 트레인, 50Hz의 주파수, 500마이크로초의 펄스 폭으로 설정합니다. 유리 피펫에 플라스미드 함유 내부 용액 5마이크로리터를 채우고 팁을 부드럽게 튕기고 여러 번 두드려 갇힌 기포를 제거합니다.

해부 현미경을 사용하여 팁이 손상되지 않았는지 확인하고 피펫 팁을 전극에 단단히 부착합니다. 팁이 aCSF와 접촉하면 전기천공기의 피펫 저항 판독값을 기록합니다. 슬라이스 배양액을 분리하려면 날카로운 칼날로 배양 삽입물 멤브레인을 자르고 날카로운 각도의 겸자를 사용하여 슬라이스 배양액을 전기천공 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 슬라이스 앵커로 배양 위치를 고정합니다.

관심 세포의 전기천공을 위해 입으로 피펫에 양압을 가하고 3차원 손잡이 컨트롤을 사용하여 피펫 팁을 슬라이스 배양 표면 근처로 조작합니다. 현미경으로 배양액을 관찰하면서 팁으로 표적 세포에 접근하여 세포 표면에 보조개가 형성될 때까지 양압을 가한 상태를 유지합니다. 딤플이 시각화되면 피펫 팁과 원형질막 사이에 느슨한 밀봉이 형성되도록 입으로 약한 음압을 빠르게 가합니다.

멤브레인이 피펫에 약간 들어갑니다. 스피커의 톤 증가로 표시되는 것처럼 피펫의 초기 저항이 약 2.5배 증가하는 것을 관찰해야 합니다. 보조개가 재형성되도록 양압을 빠르게 다시 가하십시오. 그런 다음 방금 시연한 대로 일시 중지하지 않고 최소 두 번의 압력 주기를 즉시 완료하십시오. 마지막 압력 펄스 후 음압을 1초 동안 유지합니다. 스피커의 톤은 음조의 안정적인 정점에 도달합니다. 풋 페달을 사용하여 전기천공기를 빠르게 펄스합니다.

전기천공 후 압력을 가하지 않고 피펫을 셀에서 약 100미크론 정도 부드럽게 집어넣고 양압을 다시 가하여 저항이 기준선 판독값과 유사한지 확인한 후 다음 셀에 접근합니다. 관심 세포가 모두 전기천공되면 슬라이스 배양액을 준비된 신선한 배양 인서트 중 하나로 옮기고 인서트를 섭씨 35도에서 최대 3일 동안 놓습니다.

• Single Cell Electroporation - A method for introducing plasmid and other substances into individual cells.
• Electroporation Chamber - The compartment used to house cultures for electroporation.
• Resistance - The opposition to the flow of electrical current, used as a readout in electroporation protocols.
• Slice Culture - Thin sections of tissue used for studying cellular and synaptic function in a preserved environment.
• Perfusion - The process of delivering a fluid, often a drug or nutrient solution, to an organ or tissue.

• Single Cell Electroporation is a technique to introduce substances into individual cells (e.g., neurons).
• Electroporation Chamber is the context for the electroporation to be done, providing tight control over conditions (e.g., temperature).
• Resistance is crucial for electroporation as it acts as a readout, indicating successful electroporation (e.g., plasmid).
• The importance of Slice Culture is to maintain the integrity of the cellular environment during experimentation.
• Perfusion plays a role in delivering control and experimental substances before, during, and after electroporation.

• What is single cell electroporation and how is it used in neurological research?
• How does an electroporation chamber facilitate this process?
• Why is measuring resistance critical in electroporation experiments?

• Single cell electroporation offers far-reaching applications for genomic studies and gene therapy (e.g., personalized medicine).
• With benefits seen in neurological research, customized equipment such as electroporation chambers is crucial (e.g., drug discovery).
• The study of resistance during electroporation provides precious insights into cellular mechanics and responses (e.g., cell biology).
• Advancements in this field will have potential long-term implications in disease treatment and our understanding of neurological diseases.