Spinal Cord Neuron Isolation: In Vitro Studies를 위해 신생아 척수 뉴런을 분리하기 위한 밀도 구배 절차

척수 뉴런을 분리하려면 신생아 마우스의 척추를 페트리 접시 위에 놓습니다. 척추를 식염수 완충액으로 세척하여 척수를 풀어줍니다. 척수를 차가운 신경 배지로 옮겨 세포 생존을 촉진합니다.

다음으로, 척수를 다지고 조각을 신선한 신경 배지가 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 적응을 위해 셰이커 수조에서 튜브를 배양합니다. 배양 후 사용한 배지를 제거하고 소화 배지를 추가합니다. 소화 효소는 조직 기질을 절단하여 세포를 느슨하게 합니다.

조직 조각을 피펫으로 흡인하여 분쇄를 수행하고 구성 요소를 신속하게 비우고 개별 세포를 현탁액으로 방출합니다. 그런 다음 이 현탁액을 밀도 구배 배지와 원심분리기가 들어 있는 튜브로 옮깁니다.

원심분리 후 튜브의 표면층에는 조직 파편이 포함됩니다. 첫 번째 층에는 희소돌기아교 세포와 성상 세포가 포함됩니다. 두 번째와 세 번째 층은 뉴런으로 구성되며 세 번째 층은 순도가 가장 높습니다. 마지막으로 펠릿에는 미세아교세포가 포함되어 있습니다.

세 번째 층을 새 튜브에 모으고 뉴런 배지를 추가하여 밀도 구배 배지를 희석합니다. 뉴런을 펠릿화하기 위해 원심분리기. 상청액을 버리고 펠릿을 신경기저 배지에 재현탁하여 추가 실험을 위해 뉴런을 보존합니다.

이 절차를 시작하려면 가위를 사용하여 안락사된 새끼 쥐의 몸에서 머리를 분리하십시오. 다음으로 등쪽이 위를 향하도록 시술대에서 꼬리와 팔을 안정시킵니다. 그런 다음 구부러진 홍채 가위를 사용하여 피부를 잘라냅니다. 그런 다음 엉덩이 바로 위의 요추 부위에서 척수를 절단한 다음 흉부의 양쪽을 절단하여 몸과 분리합니다.

밀리리터의 멸균된 PBS가 들어 있는 3개의 10센티미터 페트리 접시에서 샘플을 각각 10초 동안 순차적으로 세척하여 과도한 조직을 제거합니다. 그런 다음 멸균된 PBS 5밀리리터로 채워진 22게이지 바늘과 주사기를 척추의 꼬리 끝에 삽입하고 두개골로 플러시하여 코드가 네 번째 페트리 접시로 빠져나갈 수 있도록 합니다.

얼음 위에 5밀리리터의 HABG와 함께 15밀리리터 튜브에 척수를 옮깁니다. 척수를 짓누르지 말고 나머지 새끼에 대해 절차를 반복하십시오. 이상적으로는 건강한 뉴런 격리를 보장하기 위해 한 그룹의 새끼에 대해 이 과정이 30분 이상 걸리지 않아야 합니다.

밀도 구배를 준비하려면 4개의 15밀리리터 튜브에 4개의 층을 각각 준비합니다. 그런 다음 각 층의 1밀리리터를 새 15밀리리터 튜브에 추가합니다. 하단의 레이어 1부터 시작하여 상단의 레이어 4에 도달할 때까지 순차적으로 추가합니다. 추가하는 동안 레이어를 방해하거나 혼합을 유발할 수 있는 격렬한 움직임을 피하십시오. 다음으로, 다진 조직에 소화 배지를 첨가합니다. 샘플을 섭씨 30도의 수조에 있는 셰이커에 넣습니다. 그런 다음 수조에서 티슈를 제거하고 몇 분 동안 가라앉히십시오.

분쇄를 수행하려면 과도한 소화 매체를 흡인하십시오. 조직을 HABG 2밀리리터에 현탁시킵니다. 협구경 피펫을 사용하여 45초 동안 10회 분쇄하고 공기 유입은 생존 가능한 수율을 크게 감소시키므로 피하십시오. 분쇄는 절차의 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 조직은 불에 연마된 피펫에 조심스럽게 끌어당기고 비워야 하며, 신경 세포 사멸로 이어질 수 있는 과도한 활력을 피하거나 너무 부드러워 수율이 낮아지는 것을 피

그런 다음 상청액의 상단 2밀리리터를 흡인하고 "컬렉션"이라고 표시된 새로운 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 수집 절차를 두 번 더 반복하여 6밀리리터의 상청액을 생성합니다. 다음으로, 수집 튜브 내용물을 이전에 준비한 그래디언트 튜브로 천천히 옮겨 그래디언트가 중단되지 않도록 합니다.

뉴런을 정제하려면 그래디언트 튜브를 800 x g 및 섭씨 22도에서 15분 동안 원심분리합니다. 원하는 층을 모아 새 15밀리리터 튜브에 옮깁니다. 최고 순도 뉴런 분리를 위해 레이어 3을 수집합니다. 더 낮은 순도로 더 많은 수확량을 얻으려면 레이어 2-3을 수집하십시오.

다음으로, 새로 수집된 층에 5밀리리터의 HABG를 추가하여 밀도 구배를 희석합니다. 섭씨 22도에서 200 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 2분 후, 상청액을 버리고 펠릿을 튕겨 세포를 5밀리리터의 HABG에 재현탁합니다. 그 후, 샘플을 섭씨 22도에서 2분 동안 200 x g으로 다시 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 버리고 펠릿을 튕겨 3밀리리터의 신경기저 배지에 세포를 재현탁합니다.