마우스 모델에서 CVP(Circumvallate Papillae) 상피의 분리: 마우스 혀에서 CVP 상피를 분리하는 효소 절차

쥐 혀의 등쪽 표면은 유두라고 하는 세 가지 주요 종류의 융기된 돌출부, 즉 곰팡이형, 원형 및 사상 유두로 덮여 있습니다. 미뢰를 수용하는 상피 트렌치로 구성된 원형 유두(CVP)는 결합 조직층인 고유층에 의해 지지됩니다.

CVP 상피를 분리하려면 누운 자세에서 안락사된 마우스로 시작합니다. 다음으로, 뺨을 절개하고 두꺼운 조직 띠(설소대)를 해부하여 구강 바닥에서 혀를 분리합니다. 절제된 혀를 식힌 완충액이 들어 있는 접시에 옮깁니다.

다음으로 혀의 앞쪽 부분을 잘라냅니다. 디스파제 및 콜라게나제 효소를 함유한 소화 칵테일을 상피와 밑에 있는 CVP 영역의 상피하 공간에 조심스럽게 주입합니다. 현탁액을 해당 부위에 주입하는 동안 바늘을 집어넣습니다.

적절한 시간 동안 혀를 배양합니다. 분산 및 콜라게나제는 결합 조직 내에서 세포외 기질 단백질을 소화하여 조직에서 CVP 상피의 분리를 촉진합니다. 배양 후, CVP 영역의 상피를 절개합니다.

느슨해진 상피를 밑에 있는 조직에서 부드럽게 분리합니다. 마지막으로, 분리된 CVP 상피를 단백질로 코팅된 튜브로 옮겨 조직이 튜브 벽에 달라붙는 것을 방지합니다. CVP 상피는 추가 다운스트림 처리를 위해 저장할 수 있습니다.

성체 쥐를 안락사시킨 후 큰 멸균 해부 가위를 사용하여 뺨을 자르고 턱을 부러뜨립니다. 그런 다음 혀를 들어 올려 설소대를 잘라 혀를 구강 바닥에서 분리합니다. 혀를 잘라내어 칼슘과 마그네슘이 함유된 멸균된 얼음처럼 차가운 dPBS에 모으십시오.

해부 현미경으로 면도날로 어금니 간 돌기의 바로 앞쪽을 잘라 전방 혀를 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 뒷혀에서 머리카락과 과도한 액체를 제거합니다.

다음으로, 1밀리리터 주사기에 200-300마이크로리터의 주사 효소 용액을 채우고 30게이지, 1/2인치 바늘을 서클간 융기 바로 위에 원형 유두 또는 CVP의 바로 내부까지 삽입합니다. 상피와 기본 조직 사이의 CVP의 측면 가장자리 아래와 측면 가장자리에 효소 용액을 주입합니다. 용액이 주입되는 동안 주사기를 혀에서 천천히 그리고 지속적으로

온에서 멸균 칼슘/마그네슘이 없는 dPBS에서 혀를 정확히 33분 동안 배양합니다. 매우 미세한 해부 가위를 사용하여 CVP의 양측 및 바로 앞쪽 상피에 작은 절단을 합니다. 그런 다음 미세한 집게로 상피를 들어 올려 부드럽게 벗겨냅니다. 트렌치 상피에 밑에 있는 결합 조직이 없으면 FBS로 미리 코팅된 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.