면봉 기반 결막 공생 박테리아 분리: 쥐 모델의 결막에서 공생 박테리아를 분리하는 기술

눈의 결막에는 공생 박테리아가 있습니다. 이 토착 미생물총은 면역 세포를 활성화하여 눈가에 들어가는 유해한 미생물을 공격함으로써 감염으로부터 눈을 보호합니다.

공생 박테리아를 분리하려면 마취된 마우스를 측면 위치에 놓습니다. 적절한 배지에 담근 멸균 눈 면봉을 가져갑니다. 젖은 면봉 끝을 왼쪽 눈의 내측 결막 부위에 삽입합니다. 안구를 누르고 면봉을 결막을 따라 앞뒤로 움직여 다양한 공생 개체군을 수집합니다.

면봉을 제거하고 미생물 농축 배지가 들어 있는 튜브에 저어줍니다. 이 단계는 면봉의 면 메쉬에서 갇힌 박테리아를 배지로 방출합니다. 면봉을 버리고 튜브를 배양하여 박테리아 성장의 시작을 촉진합니다.

눈 면봉에 접종된 농축 배지 몇 방울을 원하는 패턴으로 혈액 한천 플레이트에 분배하고 배양합니다. 배지에 존재하는 카제인과 대두 펩톤은 펩타이드 합성에 필요한 질소를 공급하는 반면 염화나트륨은 삼투압 평형을 유지합니다.

공생 박테리아는 혈액 매질에 존재하는 헤모글로빈을 소화하는 용혈 효소를 가지고 있습니다. 이것은 한천 플레이트에 특징적인 패턴을 생성하여 다양한 박테리아가 형태학적으로 별개의 콜로니로 증식하게 합니다. 결막에서 상대적인 풍부도를 결정하기 위해 콜로니의 수를 계산합니다.

뒷발 패드를 쥐어짜서 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 움직임이 없는 경우에만 진행하십시오. 한 손은 마취된 쥐를 다루고 다른 손은 눈 면봉과 배양을 다루도록 지정합니다. 케이지에서 마우스를 제거하고 왼쪽 눈을 노출시킨 상태에서 옆으로 눕힌 작업 표면 위에 놓습니다. 장갑을 낀 손에 이소프로판올을 뿌리고 종이 타월로 말리십시오.

전용 배지 취급 손으로 라벨이 부착된 BHI 미세 원심분리기 튜브의 뚜껑을 열고 튜브를 랙에 다시 놓습니다. 면봉의 면봉 끝을 BHI에 담그십시오. 그런 다음 팁을 내부 튜브에 대고 두 번 돌리면서 튜브에서 면봉을 빼내어 과도한 액체를 제거하고 제거합니다.

마우스를 다루는 손으로 마우스의 목덜미를 부드럽게 잡습니다. 다른 손으로 눈 면봉의 끝을 왼쪽 눈의 내측 결막 부위에 대십시오. 안구를 가볍게 누르고 면봉을 아래 눈꺼풀과 눈 사이에서 창문 세척 동작으로 10회 움직여 일정한 압력을 유지합니다. 털을 건드리지 않고 면봉 끝을 삽입한 위치와 수직으로 부드럽게 제거합니다. 면봉 면면이 아래로 향하도록 BHI 배지가 있는 라벨이 부착된 미세 원심분리기 튜브에 직접 넣습니다.

면봉으로 채취한 눈에 안약을 바르십시오. 원하는 경우 대조군 샘플용 피부 또는 모피 면봉을 확보하고 각 면봉 사이에 장갑을 적절하게 소독합니다. 완료되면 마우스를 케이지로 되돌립니다. 면봉을 얼음 위에 10-15분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 장갑을 낀 손을 소독하고 팁을 배지에 10회 회전 동안 혼합하면서 면봉을 제거합니다. 팁을 튜브 내벽에 대해 5회 회전하여 면봉을 빼내고 생물학적 위험 용기에 폐기합니다. 각 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다.

튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 정적으로 배양하여 샘플을 농축합니다. 배양하는 동안 마우스 눈 면봉 또는 대조군 면봉당 실온 TSA 플레이트 1개에 라벨을 붙이고 반으로 나눕니다. 인큐베이터에서 농축된 샘플을 꺼내 얼음 위에 놓습니다. 혼합할 샘플을 잠시 소용돌이치십시오. 그런 다음 샘플 10마이크로리터를 TSA 플레이트에 분취하고 플레이트를 기울여 스트립을 형성합니다. 이것을 두 번 반복합니다.

플레이트 구분선의 반대쪽에 각각 10마이크로리터의 샘플로 10개의 점을 만듭니다. 한천 플레이트가 건조되는 것을 방지하는 깨끗한 챔버에서 플레이트를 섭씨 37도에서 18시간, 2일 및 4일 동안 배양합니다. 스트립의 식민지를 세십시오. 형태를 기록하고 형태학적으로 유사한 분리주에 대한 면봉당 콜로니 형성 단위를 계산합니다.