다광자 현미경 기반 혈관 시각화를 위한 이미징 픽스처 지원 마우스 간 스테이징: 마우스 간 혈관의 다차원 이미지를 얻기 위한 안정화 장치 보조 이미징 기술

다광자 현미경을 사용하면 살아있는 조직 내에서 형광 표지된 맥관 구조의 고해상도 3차원 이미지를 캡처할 수 있습니다. 누운 자세에서 마취된 마우스로 시작합니다.

형광단 접합 덱스트란의 현탁액을 꼬리 정맥에 조심스럽게 주입합니다. 주입된 분자는 순환계를 통해 흐르고 간과 같은 기관에 도달합니다. 형광 염료는 혈관 혈청에 라벨을 붙여 혈관의 시각화를 돕고, 부착된 고분자량 덱스트란은 혈관 구조에서 혈관이 누출되는 것을 방지합니다.

마우스의 복부를 준비합니다. 진공 펌프에 연결된 이미징 렌즈 함유 흡입 링이 장착된 장기 이미징 프레임의 바닥으로 옮깁니다. 흉골 하부 경계를 따라 절개하여 간을 노출시킵니다.

흡입 링을 간으로 안내하고 흡입 링의 수정체에 간이 흡착되는 것을 촉진하는 진공 또는 음압을 가합니다. 이 단계는 이미징 중 모션 아티팩트를 줄입니다. 마우스 포함 이미징 프레임을 다광자 레이저 스캐닝 현미경 스테이지로 옮깁니다.

고해상도 이미징을 위한 침지 매체 역할을 하는 식염수로 렌즈를 덮습니다. 이미징 중에 집중된 장파장 저에너지 광자는 더 깊은 조직 침투를 허용하고 초점에서 혈관의 형광단을 자극하여 형광 신호의 방출 및 감지를 유발합니다.

다양한 깊이에서 선택된 광학 섹션의 일련의 스캔은 조직 내 혈관의 완전한 3차원 이미지를 재현합니다.

마취된 8주 된 수컷 C57BL/6 마우스에서 교정 반사의 부족을 확인한 후, 75% 알코올로 마우스의 꼬리를 닦고 30게이지 바늘이 장착된 1마이크로리터 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란 100마이크로리터에 새로 준비된 로다민 B 이소티오시아네이트-덱스트란을 밀리리터당 10밀리그램을 꼬리 꼬리 정맥에 주입합니다.

모든 용액이 전달되면 면봉을 사용하여 천자 부위에 압력을 가하고 멸균수에 적신 거즈를 사용하여 복부 털을 적십니다. 면도기를 사용하여 복부를 면도하고 털 방향으로 스트로크를 한 다음 마우스를 섭씨 37도의 알코올 소독 가열 패드 위에 놓습니다.

마우스 간을 신체 장기 이미징 프레임으로 고정하려면 먼저 깨끗한 직경 5mm 흡입 컵을 고정 위치에 놓고 가열 패드와 흡입 컵을 75% 알코올로 닦습니다. 흡입 컵을 진공 펌프 호스에 연결하고 펌프를 켭니다.

75% 알코올 멸균 테이블에서 수술용 가위를 사용하여 마우스의 흉골 아래쪽 경계에서 2cm의 피부를 잘라내고 간을 노출시킵니다. 마우스와 가열 패드를 바디 프레임의 홀더 베이스에 놓고 흡입 컵이 간을 고정할 수 있도록 장기 이미징 고정 장치를 조정합니다. 그런 다음 간이 컵에 부착되도록 흡입을 위해 30-35킬로파스칼의 음압을 사용합니다.

다광자 레이저 주사 현미경을 설정하려면 현미경을 켜고 60x 대물렌즈를 선택합니다. 프레임과 마우스를 대물렌즈 아래에 고정하고 렌즈를 덮을 만큼 큰 컵에 생리 식염수 한 방울을 추가합니다. 렌즈가 생리 식염수에 닿도록 대물렌즈를 조정하고 레이저 소프트웨어를 켭니다.