JoVE 실험 백과사전
생물학
0 조회수 • 4:51 분 • July 8th, 2025
심장의 대동맥 판막은 조밀한 세포외 기질 전체에 분포된 내부 판막 간질 세포 또는 VIC와 그 위에 있는 판막 내피 세포 또는 VEC로 구성된 삼엽 구조입니다.
VIC를 분리하려면 먼저 안락사된 마우스를 누운 자세로 준비합니다. 정중선 복부 및 흉부 절개를 통해 심장을 노출시킵니다. 좌심방과 심실 사이에 작은 상처를 만든 다음 식염수 관류를 통해 혈액을 배출합니다. 대동맥궁 수준에서 상행 대동맥을 절단하고 심장을 채취합니다.
심실의 원위 2/3를 횡단하여 폐기한 후 심장의 나머지 부분을 세로로 해부하여 'U자형' 대동맥 판막 전단지를 드러냅니다. 전단지를 절제하고 차갑게 식힌 완충액으로 헹구어 혈액을 제거합니다.
그 후, 전단지를 저농도 콜라게나제 용액으로 처리하고 배양합니다. 저농도에서 단백질 분해 효소인 콜라게나제는 세포외 기질을 부분적으로만 분해하여 전단지에서 표면 VEC를 제거합니다.
원심분리하고 효소 함유 상청액을 완충액으로 교체하여 재현탁된 펠릿을 페트리 접시로 옮깁니다. 전단지를 수집하고 두 번째 소화를 위해 고농도 콜라게나제 용액으로 처리합니다. 배양 시 콜라게나제는 세포외 기질을 추가로 분해하여 VIC를 용액으로 방출합니다.
원심분리하여 VIC를 펠릿화하고 적절한 매체에 재현탁합니다. 마지막으로, VIC가 웰 바닥에 부착되도록 소량의 세포 현탁액을 멀티웰 플레이트에 시드합니다. VIC가 증식할 수 있도록 배양합니다.
실험을 시작하기 전에 모든 수술 기구와 작업 공간을 70% 에탄올로 세척 및 멸균하고 수술 기구를 30분 동안 오토클레이브합니다. 초기 설정이 준비되면 에탄올을 사용하여 안락사된 8주 된 마우스의 가슴과 복부 부위를 청소하는 것으로 시작합니다.
가위를 사용하여 마우스의 복부와 가슴을 엽니다. 그런 다음 작은 수술용 가위로 좌심방과 좌심실 사이를 자릅니다. 10밀리리터의 차가운 PBS를 관류하여 심장에서 혈액을 제거하고 상행 대동맥의 3밀리미터를 유지하면서 심장을 절단합니다. 입체 현미경으로 심실 중앙에서 심장을 수평으로 절단하고 좌심실을 대동맥 쪽으로 절단하여 대동맥 판막을 해부합니다. 그런 다음 대동맥 판막을 조심스럽게 해부하십시오. 작은 35mm 조직 배양 접시에 판막을 함께 모으십시오.
분리된 판막을 75밀리리터 세포 배양 접시에 항생제가 보충된 새로 준비된 10밀리몰 저온 HEPES 5밀리리터와 함께 세척하고 5밀리리터의 콜라게나제 I형에서 섭씨 37도에서 30분 동안 계속
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요