Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: 마우스 대동맥 판막에서 VIC를 분리하고 배양하는 효소 방법

심장의 대동맥 판막은 조밀한 세포외 기질 전체에 분포된 내부 판막 간질 세포 또는 VIC와 그 위에 있는 판막 내피 세포 또는 VEC로 구성된 삼엽 구조입니다.

VIC를 분리하려면 먼저 안락사된 마우스를 누운 자세로 준비합니다. 정중선 복부 및 흉부 절개를 통해 심장을 노출시킵니다. 좌심방과 심실 사이에 작은 상처를 만든 다음 식염수 관류를 통해 혈액을 배출합니다. 대동맥궁 수준에서 상행 대동맥을 절단하고 심장을 채취합니다.

심실의 원위 2/3를 횡단하여 폐기한 후 심장의 나머지 부분을 세로로 해부하여 'U자형' 대동맥 판막 전단지를 드러냅니다. 전단지를 절제하고 차갑게 식힌 완충액으로 헹구어 혈액을 제거합니다.

그 후, 전단지를 저농도 콜라게나제 용액으로 처리하고 배양합니다. 저농도에서 단백질 분해 효소인 콜라게나제는 세포외 기질을 부분적으로만 분해하여 전단지에서 표면 VEC를 제거합니다.

심분리하고 효소 함유 상청액을 완충액으로 교체하여 재현탁된 펠릿을 페트리 접시로 옮깁니다. 전단지를 수집하고 두 번째 소화를 위해 고농도 콜라게나제 용액으로 처리합니다. 배양 시 콜라게나제는 세포외 기질을 추가로 분해하여 VIC를 용액으로 방출합니다.

원심분리하여 VIC를 펠릿화하고 적절한 매체에 재현탁합니다. 마지막으로, VIC가 웰 바닥에 부착되도록 소량의 세포 현탁액을 멀티웰 플레이트에 시드합니다. VIC가 증식할 수 있도록 배양합니다.

실험을 시작하기 전에 모든 수술 기구와 작업 공간을 70% 에탄올로 세척 및 멸균하고 수술 기구를 30분 동안 오토클레이브합니다. 초기 설정이 준비되면 에탄올을 사용하여 안락사된 8주 된 마우스의 가슴과 복부 부위를 청소하는 것으로 시작합니다.

위를 사용하여 마우스의 복부와 가슴을 엽니다. 그런 다음 작은 수술용 가위로 좌심방과 좌심실 사이를 자릅니다. 10밀리리터의 차가운 PBS를 관류하여 심장에서 혈액을 제거하고 상행 대동맥의 3밀리미터를 유지하면서 심장을 절단합니다. 입체 현미경으로 심실 중앙에서 심장을 수평으로 절단하고 좌심실을 대동맥 쪽으로 절단하여 대동맥 판막을 해부합니다. 그런 다음 대동맥 판막을 조심스럽게 해부하십시오. 작은 35mm 조직 배양 접시에 판막을 함께 모으십시오.

된 판막을 75밀리리터 세포 배양 접시에 항생제가 보충된 새로 준비된 10밀리몰 저온 HEPES 5밀리리터와 함께 세척하고 5밀리리터의 콜라게나제 I형에서 섭씨 37도에서 30분 동안 계속 진천합니다. 배양 후, 튜브를 150 x g에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 2밀리리터의 밀리몰 HEPES로 30초 동안 고속으로 소용돌이치면서 한 번 세척합니다.

생성된 현탁액을 튜브에서 35mm 배양 접시로 수집하고 얇은 핀셋을 사용하여 조직 조각을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 펠릿을 15밀리리터 튜브에 5밀리리터의 콜라게나제 I형을 섭씨 37도에서 35분 동안 계속 교반하면서 배양합니다. 1밀리리터 피펫으로 재현탁하여 세포를 분리하고 섭씨 4도에서 5분 동안 150 x g으로 원심분리합니다. 분리된 펠릿을 완전 DMEM 2밀리리터에 재현탁하고 섭씨 4도에서 5분 동안 150 x g으로 원심분리하여 세포를 두 번 세척합니다.

도금의 경우, 펠릿을 1밀리리터의 완전 배지에 재현탁하고 최소량의 배지에서 6웰 세포 배양 접시의 웰 1개에 첨가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 방해받지 않도록 유지하십시오. 배양 3일 후, 현미경으로 세포를 관찰하여 조직 파편에 더 가까운 성장을 확인합니다. 1,000개의 세포가 보이면 고압멸균 핀셋으로 조직 파편을 조심스럽게 제거하고 배지를 교체합니다.