Name: 마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 배우세요 마우스 태아 뇌 발달 연구를 위한 자궁내 전기천공법으로, 섬유 광케이블을 활용한 정밀 시각화와 바늘형 전극을 통한 심부 뇌 구조의 효율적인 유전자 전달 방법을 익히세요.

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이 작품은 RIKEN 뇌 과학 연구소 (BSI), 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP) (TS에게 수여) 및 RIKEN 주니어 리서치 연결 프로그램 (JRA, MK에게 수여) RIKEN 뇌 과학 연구소 (BSI), 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 투자되었다 (HFSP) (TS에게 수여) 및 RIKEN 주니어 리서치 연결 프로그램 (JRA, MK에게 수여)이 작품을 후원.

1. 분사에 대한 모세관과 DNA 솔루션의 준비 <ol><li> 맥시 - 준비 또는 이와 동등한 방법으로 플라스미드 DNA를 정화, 후 2-3 μg / μl의 최종 농도합니다. 나누어지는 DNA의 100 μg가 빠르고, 녹색 염료 (1 % 주식) 및 TE의 10μl를 추가 (10mM 트리스베이스, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션, 산도 8.0)와 1μg /에 분사 혼합의 최종 DNA 농도를 100 μl로 음량을 조절 μl. 플라스미드 DNA의 농도를 변경할 수있다는 개별적으로 테스트해야 자사의 transfection 효율 또한 플라스미드의 크기에 따라 달라집니다합니다. </li><li> 실온에서 14,000 rpm으로 5 분 DNA 솔루션을 스핀하고 잔류물을 제거 뜨는 수집합니다. </li><li> micropipette의 풀러를 사용하여 유리 모세관 tubea 유리 모세관 튜브를 당겨. 팁는 20-30 μm의 직경을 가지고 만들어 포셉와 팁을에서 핀치. 끝에서 800 μm의 - 1mm를 측정하고 외부 직경 미만 60 μm의 (그림 1A)입니다 확인하십시오. </li><li> micromanipulator에 모세를 연결하고, 미네랄 오일과 함께 입력합니다. DNA 솔루션 잠수함 솔루션에 팁으로 모세관을 입력하고 DNA 용액을 빨아합니다. </li></ol> 2. 백금 전극을 스틱 여기에는 피질 (그림 1 층)로 두뇌의 표면 지역에 electroporate에 충실 플래티넘 전극 (Nepe 유전자, CUY611P2 - 1)을 사용합니다. 3. 마이크로 전극의 준비 두뇌 (즉, 시상과 시상 하부) (그림 2B - E)의 깊은 부분으로 electroporated에 마이크로 전극을 사용하십시오. <ol><li> 하나 텅스텐 끝 (부정적인 전극) 및 백금 (긍정적인 전극)을 전선은 금도금 핀에 코일과 parafilm로 고정됩니다. 면봉의 줄기에 철사를 삽입하고 parafilm (그림의 1B)와 양쪽을 포장. </li><li> 그것이 800 20-30 μm의 외부 직경 60 μm의 μm의 - 1 끝의 mm (그림 1C 및 D)를 도달할 때까지 균일하게 사포와 와이어의 끝부분을 날카롭게. </li><li> 절연을위한 와이어 매니큐어가 손톱의 얇은 외투를 적용하십시오. 매니큐어가 건조되면, 팁 (끝부분에서 약 200 μm의)에서 제거하는 아세톤 묻은 면봉을 사용합니다. 중요 참고 : 마우스의 자궁에 손상을 방지하기 위해, 800 시간 부분 μm의 - 1 끝의 mm 직경에 더 이상 70 이상 μm의 (그림 1E)해야합니다. </li></ol> 4. 수술 준비 <ol><li> 임신 마우스 (E9.5 - E15.5)을 마취. 우리는 제약 학년 나트륨 pentobarbital로 anesthetization을 증명 (표 II, g 체중 당 50 μg은 intraperitoneally을 주입하고 5 분 기다). 마취로 pentobarbital 나트륨에 대한 대안은 케타민을 / Xylazine 주입 또는 가스 anesthetics을 (가스 짧은 기간 절차에 대한 것이 바람직합니다)가 있습니다. 주사 어떤 기관을 피하기 위해주의와 함께 이루어져야합니다, 그렇지 않으면 그것은 자궁가 손상되거나 동물을 죽이는 원인이됩니다. 성공적인 IP가 완료되면 생존율 이상 95%입니다. 또한 수술은 야외 환경에서 수행할 수 있습니다. 전에 마취를 확인하기 위해 발가락을 곤란하게하기 위해 동물의 응답의 부족에 대한 작업, 테스트를 시작했다. </li><li> 면도날과 50 % EtOH를 사용하여 복부에서 머리를 면도. betadine과 알코올의 스크럽 (70 %)을 교대로 피부를 준비합니다. </li><li> 고급 가위로 복부 정중선에서 절개를하고 37에 신중하게 모든 자궁 뿔을 꺼내 ° C 사전 예열 인산 버퍼 호수 (PBS) moistened 상처 주위에 배치됩니다 코튼 거즈를. PBS 당시의 모든 자궁 촉촉한 보관하십시오. </li><li> 색인과 중간 손가락 사이 유연한 광섬유 케이블을 잡고 자궁 경적 아래로 놓으십시오. 사용하기 전에 70 % EtOH로 청소 케이블. 아무도 현미경이나 돋보기가 시각화가 필요하지 않습니다. 위치 광섬유 조명 광 케이블과 엄지손가락 사이에 자궁과 가까운 자궁 벽에 배아를 밀어 부드럽게 쥐어 짜기. </li></ol> 5. DNA와 electroporation의 분사 <ol><li> 태아가 위치하면, 유리는 대상 꽂혔어 조심스럽게 모세관과 DNA 솔루션의 약 1 μl (그림 2A)를 주입 삽입합니다. </li><li> electoporation에 대한 스틱 백금 전극과 함께 사용하여 brainIf의 표면 부분 electroporation 들어, 자궁의 외부 전극을 배치하고 (표 I) 제조의 지시에 따라 제안 평방 파 전류 펄스를 적용합니다. 두뇌의 깊은 부분에 usingFor의 electroporation은 nmicro의 electroporation은 eedle 입력 전극을 사용하는 경우. Iinsert DNA에 잘 텅스텐 음극은 평방 파 전류 펄스 (표 I) (그림 2B)를 제안 적용 후, 두 전극 사이에 자궁과 장소 대상 지역으로 뇌실과 백금 전극을 주입. </li></ol> 6. 포스트 electroporation <ol><li> 는 원본보다 실적이있는 자궁 호른 다시 플레이스inal과 위치와 37 ° C 사전 예열 PBS 500 μL를 추가합니다. </li><li> 9mm autoclipauto 클립과 수술 봉합과 가까운 바깥쪽 레이어와 내부 레이어를 봉합해. </li><li> 2 시간 동안 가열 패드 플레이스 동물은 마취에서 회복을 허용합니다. 이러한 carprofen 또는 buprenorphine 같은 진통제는 통증에 대한 게시물 수술 시행하실 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : pCAG - EYFP의 대뇌 피질의 electroporation의 몇 가지 예입 다른 시간 지점에서 스틱 백금 전극을 사용하는 구성은 그림 그림 32에 표시됩니다. 두뇌는 E13.5, E14.5 E15.5과에서 electroporated하고, 출생 후의 일 (P) 6 수확하고 있습니다. RORc의 AThe ntibody의 얼룩은 레이어 4 EYFP transfected 세포의 위치의 위치가 GFP의 항체 염색법에 의해 밝혀 아르 공개, 두 이미지 (그림 3A와 B) 슈퍼 부과됩니다. 라벨 피질 세포는 electroporated 대뇌 피질 세포의 계층이 명확하게 시간 의존 electroporation은 대뇌 피질의 특정 계층 고프 / LOF 가능하게 제시 각 실험 (그림 32)에 차이가 있습니다. 세포 transfection의 배아 및 효율성의 생존 능력이 배아의 연령 electroporation의 위치에 따라 다릅니다. 샘플 표 1에 나열되어 있습니다, 그러나, 조건이 무대와 두뇌의 한 부분에 따라 각각의 electroporation을 위해 최적화해야합니다. 이러한 스틱 백금 전극을 이용하여 시상과 시상 하부로 깊은 조직으로 Electroporation은 종종 낮은 효율성을 (표 1) 제공합니다. 이 문제는 마이크로 전극에게 두뇌의 깊은 부분에 도달합니다 whichelectrodes를 사용하여 해결할 수 있습니다. 그림 3 개발 diencephalon에 pCAG - EYFP electroporation 4 보여주는 예제. 플라스미드 DNA 솔루션은 E11.5에서 제 3 뇌실로 주입 및 마이크로 electroporation (그림 3C4C)이옵니다. electroporated 영역은 시상 제한됩니다 어디 피질 (그림 3B4B)에 axons 프로젝트의 대부분. 피질의 레이어 4 액슨 투영은 전체 신경 세포를 fillesfills EYFP에 의해 또한 시각하실 수 있습니다. (그림 3A4A). <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 모세관의 정확한 모양을 보여주는 만화의 약도. (A) 유리 모세관 특정 형태를 만들기 위해 micropipette의 풀러를 사용하여 뽑아 있습니다. 팁는 20-30 μm의를 만들기 위해 집게로 슬쩍 꺼져 있습니다. 팁 (레드 브래킷)에서 800 μm의 - 1mm를 측정하고 외부 직경 미만 60 μm의 (녹색 브래킷)되어 있는지 확인합니다. 텅스텐 또는 백금 와이어 (B) 한쪽은 금도금 핀에 코일과 parafilm로 고정됩니다. 그런 다음 끝의 1mm 20-30 μm의 외부 직경 60 μm의되기 위해 자신의 팁을를 만들기 위해 모래 종이를 사용합니다. 텅스텐 와이어 (C) 이미지 구체화하기 전에. 성형 후 텅스텐 와이어 (D) 이미지. 매니큐어의 얇은 외투를 적용 후 텅스텐 와이어 (E) 이미지. E 규모 막대 CE 10 μm의 (작은 규모)입니다. (F) 스틱 백금 전극 (NEPA 유전자. CUY611P2 - 1). F 규모 막대는 2mm입니다. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 수술의 그림 2. 만화 스키마. 측면 뇌실이나 대형 배아 (왼쪽)로, 3 차의 뇌실 또는 작은 태아 (오른쪽)로 분사의 (A) 다이어그램. 백금 스틱 전극 (왼쪽)와 바늘 용접봉 (오른쪽)으로 electrporation의 (B) 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 마우스 telencephalon 개발은 E13.5 (A), E14.5 (B)와 E15.5 (C)에서 pCAG - EYFP와 electroporated와 P6에서 수확했다. 뇌는 따로 코로나 sectioned 및 GFP 항체 또는 항체 RORc 물들일되었고 이미지가 병합됩니다. E13.5 transfect 많은 계층 4 뉴런에서 pCAG - EYFP 플라스미드의 (A) Electroporation. 어느 4 마커 RORc 레이어와 중복됩니다. 레이어 4 뉴런보다 표면 아르 E14.5 transfect 세포에서 pCAG - EYFP 플라스미드의 (B) Electroporation. 이러한 계층 3분의 2 등 (C) E15.5 electroporation 레이블 많은 천박한 뉴런. 스케일 바 200 μm의. <img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. thalamo - 대뇌 피질의 axons (TCA)에 EYFP의 Transfection. (A) 대뇌 피질의 레이어 4 TCA 터미는 GFP의 항체 염색법에 의해 드러났습니다. RORc 항체의 얼룩은 레이어 4의 위치를​​ 공개하는 데 사용됩니다. 두 이미지는 동일한 섹션에서 촬영한과 병합됩니다. (B) 시상에 electroporation의 위치는 표현이 시상 11 제한되어 GFP의 항체 얼룩과 RORc 염색법에 의해 표시됩니다. (C) thalamic electroporation과 TCA 프로젝션을위한 만화의 약도가 표시됩니다. 스케일 바 200 μm의.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 서로 다른 모양의 전극을 사용하여 작은 배아 두뇌의 제한 구역에 pCAG - EYFP transfection의 기술의 장점을 설명했다. 다른 발기인에 의해 transfection 효율 비교는 이전에 설명한 경우, 이것은 세포 유형 특이성 1 보여줍니다. 그러나, transfection 등 기술에 대한 제한은 일시적이고 플라스미드에 따라 차이가있다, 그것은 모든 세포 특이성을하지 않으며 그것은 transfected 세포의 숫자를 제어하기 어렵다. ThereforeHowever은 다른 기법이 프로토콜을 결합하면 더욱 다양한 조작 방법에 대한 가능성을 제공합니다. 첫째, 플라스미드 DNA에 특정 셀 모터를 통합하면 이러한 뉴런, glial 세포 및 astrocytes 같은 셀 타입의 특정 transfection을하실 수 있습니다. 둘째, transfection이 과도이기 때문에, 그것은 나중에 유전자의 기능을 분석하려는 과학자에 적합하지 않습니다. 따라서 플라스미드 DNA가 게놈에 통합하기 위해 transposase와 조합은 안정적인 transfection 8로 변환됩니다. tet - 또는 tet - 오프 시스템의 다음, 채택은 가능한 8 신경 세포의 타이밍이나 세포 유형 특정 유전자 발현을 조작하는 것입니다. 또는, 하나는 tamoxifen - inducible Cre 호텔 - ER (T) recombinases 9 기자 마우스 10이 프로토콜을 조합하여 사용할 수 있습니다. 조직의 광범위한 접근은 크게 신경 과학에서 사용되는 실험 설계 변경됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 베어 텅스텐 와이어 직경 125 μm의 </td><td> AM 시스템 </td><td> 797600 </td></tr><tr><td> 베어 백금 와이어 직경 125 μm의 </td><td> AM 시스템 </td><td> 767000 </td></tr><tr><td> 스틱 전극 </td><td> NEPA 유전자 </td><td> CUY610P4 - 1 </td></tr><tr><td> 유리 모세관 </td><td> 스토엘팅 </td><td> 50,611 </td></tr><tr><td> micromanipulator </td><td> KD 과학 </td><td> KDS310 </td></tr><tr><td> 가위 </td><td> ROBOZ </td><td> RS - 5865 </td></tr><tr><td> 펄스 발생기 </td><td> AM 시스템 </td><td> 모델 2100 </td></tr><tr><td> 9mm autoclip </td><td> ROBOZ </td><td> RS - 9260 </td></tr><tr><td> 금도금 핀 </td><td> WPI </td><td> 5482 </td></tr><tr><td> RORc 항체 </td><td> 페르세우스 Proteomics </td><td> H3925 </td></tr></tbody></table>

마우스 utero에 electroporation : 통제 spatiotemporal 진 transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

신호 분자와 축삭지도 분자, 지방 유전자 전송 또는 노크 아웃이 필요합니다을 포함하여 개발 두뇌의 특정 영역에서 표현 유전자의 기능을 이해하기 위해서. 지역 지역에 안으로 또는 노크 아웃 타겟 유전자는 특정 힘드는, 비용이 많이 드는 CRE 라인, 그리고 시간이 소요와 함께 함께 수행할 수 있습니다. 따라서, 간단한 transfection 방법, 짧은 시간에 수행할 수 있습니다에서 utero의 electroporation 기술은, 사전에 유전자 변형 동물의 1,2 세대의 후보 유전자의 가능한 함수를 테스트하는 것이 편리할 것입니다. 이 외에도, utero의 electroporation에 특정 CRE 라인은 존재하지 않는 두뇌의 영역을 대상으로하고, 배아 파괴 장면을 보여 주죠에게 3,4를 제한합니다. 여기, 우리는 개발 두뇌의 대상 영역으로 간단하고 편리한 유전자 전달을위한 전극의 두 가지 종류의 결합 utero의 electroporation에의 방법을 제시한다. 첫째, 광학 광섬유 조명 케이블을 사용하여 태아의 독특한 지주 방법은 심실 및 타겟 뇌 영역 5,6에 바늘 형태 전극 삽입에 타겟 DNA 용액 주입을위한 보이는 작은 배아 (E9.5에서) 할 것입니다. 같은 피질 영역으로 뇌의 patterning 따라서, E9.5에서 이러한 초기 electroporation은 전체 지역 patterning 이벤트를 이해하기 위해 큰 공헌을 초기 배아 단계에서 발생합니다. 둘째, 모세관의 정확한 모양은 모세 삽입하여 구멍을함으로써 자궁 손상을 방지합니다. 또한, 바늘 전극의 정확한 모양은 텅스텐과 백금 와이어로 만든 모래 종이를 사용하여 날카롭게하고 매니큐어 7이 프로토콜 큰 자세히 설명되어있는 방법으로 절연하고 있습니다. 이 독특한 기술은 두뇌의 제한된 영역에 플라스미드 DNA의 transfection을 허용 작은 배아가 electroporated 수 있도록합니다. 이것은 아주 초기 배아 단계에서 세포 분화, 세포 이주, 축삭지도에 최선을 다하고 있습니다 많은 과학자를위한 새로운 창을 열고하는 데 도움이 될 것입니다. 또한,이 기술은 과학자들이 이러한 많지 않아 특정 지역과 관련된 CRE 라인 함수의 이득 (고프) 또는 기능 (LOF) 분석의 손실에 대해 존재하는 시상과 시상 하부로 개발 두뇌의 깊은 부분으로 플라스미드 DNA를 transfect 수 있습니다.

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

신호 전달 분자와 축삭 유도 분자를 포함하여, 발달 중인 뇌의 특정 영역에서 발현되는 유전자의 기능을 이해하기 위해서는...

본 절차의 전반적인 목표는 원하는 발달 시점과 뇌 영역의 생쥐 배아 중추신경계에서 효율적인 유전자 형질전환을 달성하는 것입니다. 이를 위해 우선 자궁 손상을 방지하기 위한 정밀 모세관과 바늘 형태의 전극을 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 표적 DNA 주입을 위해 광섬유 라이트 케이블을 사용하여 작은 배아를 시각화하고, 이를 고정하는 독특한 방법을 익히는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 자궁 표면에 스틱형 전극을 사용하여 전기천공법을 수행함으로써 뇌의 표층 부위에 DNA를 형질전환시키는 것이며, 절차의 마지막 단계는 시상 및 시상하부와 같은 뇌의 심층 구조에 바늘형 전극을 사용하여 전기천공법을 수행하는 것입니다. 결과적으로 피질층의 특이적 형질전환 또는 시상 내의 효율적인 형질전환을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적인 자궁 내 주입과 같은 기존 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 자궁 내 배아의 주입 부위에 대한 가시성과 제어력이 더 뛰어나다는 점입니다.우리는 광섬유와 유사한 케이블을 사용하여 E 9.5부터 배아를 시각화하고, 니들 하이포(needle hypos)를 통해 시상 및 시상하부와 같은 뇌의 더 깊은 부분으로 플라스미드 DNA를 전달합니다. 이 방법은 신경 분화, 뇌 패턴 형성, 신경 연결성과 같이 발달 중인 뇌에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 니들과 전극의 모양을 잡고 정확한 위치를 맞추는 것이 어렵기 때문에 숙달하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.자궁 및 배아의 시각적 시연은 정밀한 바늘 전극을 제작하고 전기천공을 위해 배아를 배치하는 방법을 확인하는 데 매우 중요합니다. 이 두 단계가 성공적인 결과의 핵심이기 때문입니다. 모세관을 준비하려면 제조업체의 지침에 따라 마이크로피펫 풀러를 사용하십시오.본 절차에서는 내부 섬유가 없는 1 mm 유리 모세관을 사용합니다. 당긴 니들의 끝부분부터 길이는 해부 현미경을 사용하여 800 µm에서 1 mm 사이여야 하며, 외경은 60 µm 미만이어야 합니다. 핀셋으로 니들 끝을 집어 지름이 20 ~ 30 µm가 되도록 조절합니다. 각 니들의 치수를 마이크로미터로 측정하십시오.다음으로, 코일링을 통해 미세 전극을 준비합니다. 텅스텐 와이어의 한쪽 끝을 금도금 핀에 감습니다. 음극에는 텅스텐 와이어를 사용하고, 양극에는 백금 와이어를 사용합니다.파라필름(param.)을 사용하여 와이어를 핀에 고정합니다. 그런 다음 면봉의 플라스틱 줄기 부분에 와이어를 삽입하고 양 끝을 필름(phim)으로 고르게 감쌉니다. 고운 사포를 이용하여 와이어 끝부분의 직경이 20~30 µm가 되고, 끝에서 800 µm~1 mm 지점의 직경이 60 µm가 될 때까지 끝을 정교하게 연마합니다. 마이크로미터를 사용하여 최종 치수를 다시 확인합니다.다음으로, 절연을 위해 끝을 날카롭게 만든 와이어를 매니큐어 한 방울에 담가 와이어 전체에 얇게 도포합니다. 매니큐어가 마르면, 아세톤을 적신 면봉을 사용하여 팁 끝부분의 마지막 200 micrometers 영역에서 매니큐어를 제거합니다. 백금 전극은 기성품으로 구매하므로 별도의 준비 과정이 필요하지 않습니다.본 절차에서는 CUY six 10 P four dash one nepo gene 전극을 사용합니다. Maxi prep 또는 이에 상응하는 방법으로 플라스마 DNA를 정제하고, DNA 100 µg을 새 튜브에 분주한 다음 1% fast green dye 10 µL를 첨가합니다. TE를 사용하여 최종 부피를 100 µL로 맞춰 플라스마 DNA의 최종 농도를 1 µg/µL로 조정합니다. 피펫팅을 통해 용액을 부드럽게 혼합한 후, 불순물과 염을 제거하기 위해 DNA 용액을 실온에서 14,000 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다.SNAT를 새 튜브로 옮깁니다. DNA 용액은 전체 과정 동안 튜브에 담아 실온에서 보관할 수 있습니다. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 마이크로 매니퓰레이터에 풀드 니들(pulled needle)을 연결하고, 니들의 팁을 DNA 용액에 담가 니들 내부를 채웁니다.마이크로 매니퓰레이터를 조심스럽게 옆으로 치워 두고 수술 전 준비를 합니다. 배아기 9.5일에서 15.5일 사이의 임신한 마우스의 체중을 측정합니다.그 다음 복강 내로 제약 등급의 sodium pentobarbital을 체중 g당 50 µg의 용량으로 주입하고 5분 동안 대기합니다. sodium pentobarbital의 대체제로 ketamine, xylazine 주사 또는 가스 마취제를 사용할 수 있습니다.마취 후, 면도날과 50% ethanol을 사용하여 복부의 털을 제거합니다. Betadine과 70% alcohol을 교대로 사용하여 피부를 소독합니다. 미세 가위로 복부 중앙선을 따라 절개합니다.상처 주위에 1x 인산완충생리식염수(PBS)로 적신 면 거즈를 배치하고, 모든 자궁각을 조심스럽게 밖으로 끌어냅니다. 자궁은 항상 PBS로 적셔 습윤한 상태를 유지하십시오. 유연한 광섬유 케이블을 사용합니다.케이블을 자궁각 아래에 배치합니다. 광섬유 조명과 엄지손가락 사이에 자궁을 위치시키고, 살짝 눌러 배아가 자궁벽에 더 가깝게 밀려 올라가도록 합니다. 배아의 머리가 왼쪽을 향하고 위를 바라보게 위치했을 때, 유리 모세관을 표적 뇌실에 조심스럽게 삽입하고 배아기 13.5일(embryonic day 13.5)의 피질 4층 전기천공법을 위해 DNA 용액 약 1 µL를 주입합니다.자궁 외부에 스틱형 백금 전극을 배치하고 38 V로 50 ms 동안 사각파 전류 펄스를 5회 가합니다. 배아 10.5일차에 시상 또는 시상하부에 도달하기 위해 미세 전기천공법을 사용하는 경우, 미세 텅스텐 음극 전극을 DNA가 주입된 뇌실에 삽입하고 백금 양극 전극을 자궁에 삽입합니다. 두 전극의 끝단 사이에 표적 영역을 위치시키고, 권장되는 사각파 전류 펄스를 7 V로 100 ms 동안 3회 가합니다.전기천공법이 완료되면 자궁각을 원래 위치로 되돌리고 500 µL의 PBS를 추가합니다. 외과용 봉합사로 절개 부위의 내층을 봉합합니다. 그런 다음 9 mm 자동 클립으로 외층을 폐쇄합니다.수술 및 마취에서 회복될 수 있도록 마우스를 가열 패드 위에 2시간 동안 둡니다. 여기서 배아기 13.5일, 14.5일 및 15.5일에 수행된 피질 영역의 백금 전천공법 적용 사례를 볼 수 있습니다. 뇌 조직은 출생 후 단계에서 채취되었습니다.6일 차. 전기천공법이 적용된 피질 세포 층이 각 실험마다 명확하게 다르게 나타납니다. 이는 시간 의존적 전기천공법을 통해 피질 층 특이적인 기능 획득 및 기능 상실이 가능함을 시사합니다.여기에서 보여주는 것처럼, 시상 및 시상하부와 같은 심부 조직으로의 전기천공법을 수행합니다. 막대 형태의 백금 전극을 사용하면 효율이 낮은 경우가 많으므로, 전기천공을 위해 미세 전극을 사용합니다. 이러한 심부 조직에서는 더 나은 효율과 생존율을 얻을 수 있습니다.마우스 배아의 제3뇌실에 플라스미드 DNA 용액을 주입하였습니다. 배아기 11.5일에 시상 부위로 제한하여 니들 전기천공법을 적용하였으며, 대부분의 시상 엑손은 생후 6일까지 피질로 투사됩니다. 본 영상에서는 발달 중인 머리 부분에 P-C-A-G-E-Y-F-P 미세 전기천공법을 수행하는 과정을 보여드립니다.시상 부위는 모든 시상 분열 후 뉴런을 표지하는 RORC에 의해 나타납니다. 피질의 4층으로 뻗어 나가는 축삭 투사는 흰색 화살표로 표시되며, 뉴런 전체를 채우는 EYFP를 통해 시각화할 수 있습니다. 피질 내 4층의 위치 또한 RORC 항체로 표지됩니다.MA가 시작되면, 이 기술을 적절하게 수행할 경우 리터당 15분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 절차 수행 후 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 테스트 샘플을 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 세포 분화 후의 분자적 메커니즘을 이해하기 위해 MDNA에 특정 염색체를 통합하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술은 중추신경계 발달 분야의 연구자들이 패턴 형성, 축삭 성장 및 회로 형성의 분자적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 돕습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을...

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를...

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

출처: Lutz, D., et al. 발달 중인 마우스 뇌 및 척수의 자궁 내 형질도입 후 초미세구조 신경가소성 매개변수의 평가. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 마우스 배아에서 자궁 내 주사를 통한 바이러스 형질도입을 보여줍니다. 임신한 쥐를 수술을 위해 준비하고 정중선 절개를 하여 자궁 뿔을 노출시킵니다. 원하는 유전자를 포함하는 바이러스와 추적 염료의 혼합물을 표적 위치의 자궁 주머니 내의 배아에 주입합니다. 그런 다음 봉합하기 전에 자궁 뿔을 다시 배치합니다.

마우스의 자궁 내 바이러스 형질도입

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

여기에서는 생체 내에서 마우스 태반의 중요한 발달 경로를 효과적으로 조작하는 시간별 방법을 설명합니다. 이것은 배아 12.5일째에 임신한 댐의 태반에 CRISPR 플라스미드를 주입하고 전기천공하여 수행됩니다.

Mouse In Vivo Placental 표적 CRISPR 조작

배우세요 마우스 태아 뇌 발달 연구를 위한 자궁내 전기천공법으로, 섬유 광케이블을 활용한 정밀 시각화와 바늘형 전극을 통한 심부 뇌 구조의 효율적인 유전자 전달 방법을 익히세요.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

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