마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

본 절차의 전반적인 목표는 원하는 발달 시점과 뇌 영역의 생쥐 배아 중추신경계에서 효율적인 유전자 형질전환을 달성하는 것입니다. 이를 위해 우선 자궁 손상을 방지하기 위한 정밀 모세관과 바늘 형태의 전극을 준비합니다. 절차의 두 번째 단계는 표적 DNA 주입을 위해 광섬유 라이트 케이블을 사용하여 작은 배아를 시각화하고, 이를 고정하는 독특한 방법을 익히는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 자궁 표면에 스틱형 전극을 사용하여 전기천공법을 수행함으로써 뇌의 표층 부위에 DNA를 형질전환시키는 것이며, 절차의 마지막 단계는 시상 및 시상하부와 같은 뇌의 심층 구조에 바늘형 전극을 사용하여 전기천공법을 수행하는 것입니다. 결과적으로 피질층의 특이적 형질전환 또는 시상 내의 효율적인 형질전환을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적인 자궁 내 주입과 같은 기존 방식과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 자궁 내 배아의 주입 부위에 대한 가시성과 제어력이 더 뛰어나다는 점입니다.

우리는 광섬유와 유사한 케이블을 사용하여 E 9.5부터 배아를 시각화하고, 니들 하이포(needle hypos)를 통해 시상 및 시상하부와 같은 뇌의 더 깊은 부분으로 플라스미드 DNA를 전달합니다. 이 방법은 신경 분화, 뇌 패턴 형성, 신경 연결성과 같이 발달 중인 뇌에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 니들과 전극의 모양을 잡고 정확한 위치를 맞추는 것이 어렵기 때문에 숙달하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

자궁 및 배아의 시각적 시연은 정밀한 바늘 전극을 제작하고 전기천공을 위해 배아를 배치하는 방법을 확인하는 데 매우 중요합니다. 이 두 단계가 성공적인 결과의 핵심이기 때문입니다. 모세관을 준비하려면 제조업체의 지침에 따라 마이크로피펫 풀러를 사용하십시오.

본 절차에서는 내부 섬유가 없는 1 mm 유리 모세관을 사용합니다. 당긴 니들의 끝부분부터 길이는 해부 현미경을 사용하여 800 µm에서 1 mm 사이여야 하며, 외경은 60 µm 미만이어야 합니다. 핀셋으로 니들 끝을 집어 지름이 20 ~ 30 µm가 되도록 조절합니다. 각 니들의 치수를 마이크로미터로 측정하십시오.

다음으로, 코일링을 통해 미세 전극을 준비합니다. 텅스텐 와이어의 한쪽 끝을 금도금 핀에 감습니다. 음극에는 텅스텐 와이어를 사용하고, 양극에는 백금 와이어를 사용합니다.

파라필름(param.)을 사용하여 와이어를 핀에 고정합니다. 그런 다음 면봉의 플라스틱 줄기 부분에 와이어를 삽입하고 양 끝을 필름(phim)으로 고르게 감쌉니다. 고운 사포를 이용하여 와이어 끝부분의 직경이 20~30 µm가 되고, 끝에서 800 µm~1 mm 지점의 직경이 60 µm가 될 때까지 끝을 정교하게 연마합니다. 마이크로미터를 사용하여 최종 치수를 다시 확인합니다.

다음으로, 절연을 위해 끝을 날카롭게 만든 와이어를 매니큐어 한 방울에 담가 와이어 전체에 얇게 도포합니다. 매니큐어가 마르면, 아세톤을 적신 면봉을 사용하여 팁 끝부분의 마지막 200 micrometers 영역에서 매니큐어를 제거합니다. 백금 전극은 기성품으로 구매하므로 별도의 준비 과정이 필요하지 않습니다.

본 절차에서는 CUY six 10 P four dash one nepo gene 전극을 사용합니다. Maxi prep 또는 이에 상응하는 방법으로 플라스마 DNA를 정제하고, DNA 100 µg을 새 튜브에 분주한 다음 1% fast green dye 10 µL를 첨가합니다. TE를 사용하여 최종 부피를 100 µL로 맞춰 플라스마 DNA의 최종 농도를 1 µg/µL로 조정합니다. 피펫팅을 통해 용액을 부드럽게 혼합한 후, 불순물과 염을 제거하기 위해 DNA 용액을 실온에서 14,000 RPM으로 5분 동안 원심분리합니다.

SNAT를 새 튜브로 옮깁니다. DNA 용액은 전체 과정 동안 튜브에 담아 실온에서 보관할 수 있습니다. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 마이크로 매니퓰레이터에 풀드 니들(pulled needle)을 연결하고, 니들의 팁을 DNA 용액에 담가 니들 내부를 채웁니다.

마이크로 매니퓰레이터를 조심스럽게 옆으로 치워 두고 수술 전 준비를 합니다. 배아기 9.5일에서 15.5일 사이의 임신한 마우스의 체중을 측정합니다.

그 다음 복강 내로 제약 등급의 sodium pentobarbital을 체중 g당 50 µg의 용량으로 주입하고 5분 동안 대기합니다. sodium pentobarbital의 대체제로 ketamine, xylazine 주사 또는 가스 마취제를 사용할 수 있습니다.

마취 후, 면도날과 50% ethanol을 사용하여 복부의 털을 제거합니다. Betadine과 70% alcohol을 교대로 사용하여 피부를 소독합니다. 미세 가위로 복부 중앙선을 따라 절개합니다.

상처 주위에 1x 인산완충생리식염수(PBS)로 적신 면 거즈를 배치하고, 모든 자궁각을 조심스럽게 밖으로 끌어냅니다. 자궁은 항상 PBS로 적셔 습윤한 상태를 유지하십시오. 유연한 광섬유 케이블을 사용합니다.

케이블을 자궁각 아래에 배치합니다. 광섬유 조명과 엄지손가락 사이에 자궁을 위치시키고, 살짝 눌러 배아가 자궁벽에 더 가깝게 밀려 올라가도록 합니다. 배아의 머리가 왼쪽을 향하고 위를 바라보게 위치했을 때, 유리 모세관을 표적 뇌실에 조심스럽게 삽입하고 배아기 13.5일(embryonic day 13.5)의 피질 4층 전기천공법을 위해 DNA 용액 약 1 µL를 주입합니다.

자궁 외부에 스틱형 백금 전극을 배치하고 38 V로 50 ms 동안 사각파 전류 펄스를 5회 가합니다. 배아 10.5일차에 시상 또는 시상하부에 도달하기 위해 미세 전기천공법을 사용하는 경우, 미세 텅스텐 음극 전극을 DNA가 주입된 뇌실에 삽입하고 백금 양극 전극을 자궁에 삽입합니다. 두 전극의 끝단 사이에 표적 영역을 위치시키고, 권장되는 사각파 전류 펄스를 7 V로 100 ms 동안 3회 가합니다.

전기천공법이 완료되면 자궁각을 원래 위치로 되돌리고 500 µL의 PBS를 추가합니다. 외과용 봉합사로 절개 부위의 내층을 봉합합니다. 그런 다음 9 mm 자동 클립으로 외층을 폐쇄합니다.

수술 및 마취에서 회복될 수 있도록 마우스를 가열 패드 위에 2시간 동안 둡니다. 여기서 배아기 13.5일, 14.5일 및 15.5일에 수행된 피질 영역의 백금 전천공법 적용 사례를 볼 수 있습니다. 뇌 조직은 출생 후 단계에서 채취되었습니다.

6일 차. 전기천공법이 적용된 피질 세포 층이 각 실험마다 명확하게 다르게 나타납니다. 이는 시간 의존적 전기천공법을 통해 피질 층 특이적인 기능 획득 및 기능 상실이 가능함을 시사합니다.

여기에서 보여주는 것처럼, 시상 및 시상하부와 같은 심부 조직으로의 전기천공법을 수행합니다. 막대 형태의 백금 전극을 사용하면 효율이 낮은 경우가 많으므로, 전기천공을 위해 미세 전극을 사용합니다. 이러한 심부 조직에서는 더 나은 효율과 생존율을 얻을 수 있습니다.

마우스 배아의 제3뇌실에 플라스미드 DNA 용액을 주입하였습니다. 배아기 11.5일에 시상 부위로 제한하여 니들 전기천공법을 적용하였으며, 대부분의 시상 엑손은 생후 6일까지 피질로 투사됩니다. 본 영상에서는 발달 중인 머리 부분에 P-C-A-G-E-Y-F-P 미세 전기천공법을 수행하는 과정을 보여드립니다.

시상 부위는 모든 시상 분열 후 뉴런을 표지하는 RORC에 의해 나타납니다. 피질의 4층으로 뻗어 나가는 축삭 투사는 흰색 화살표로 표시되며, 뉴런 전체를 채우는 EYFP를 통해 시각화할 수 있습니다. 피질 내 4층의 위치 또한 RORC 항체로 표지됩니다.

MA가 시작되면, 이 기술을 적절하게 수행할 경우 리터당 15분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 절차 수행 후 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 테스트 샘플을 매우 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 세포 분화 후의 분자적 메커니즘을 이해하기 위해 MDNA에 특정 염색체를 통합하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 중추신경계 발달 분야의 연구자들이 패턴 형성, 축삭 성장 및 회로 형성의 분자적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 돕습니다.