Bacterial Infection Quantitation Assay: A Method to Quantify intraocular Bacterial load in Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis(세균성 안구내염의 마우스 모델에서 안구 내 세균 부하를 정량화하는 방법)

세균성 안내염은 병원성 박테리아인 Bacillus cereus가 안내 부위를 감염시킬 때 발생하는 염증성 안구 질환입니다.

세균 감염을 정량화하기 위해 세균성 안내염의 안락사된 마우스 모델을 수술대에 측면으로 놓습니다. 눈 밑에 가벼운 압력을 가하여 안구를 소켓에서 분리하는 데 도움을 줍니다. 안구를 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 적절한 완충액이 들어 있는 튜브로 옮깁니다.

안구 조직을 균질화하여 분해하고 현탁액에서 박테리아를 방출합니다. 완충액에 존재하는 프로테아제 억제제는 박테리아 생존력을 유지하기 위해 방출된 세포 프로테아제를 비활성화합니다. 다음으로, 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 다양한 농도의 Bacillus cereus를 얻습니다.

농축된 한천 배지가 들어 있는 각진 배양 플레이트를 가져다가 각 희석 농도에 해당하는 행을 구분합니다. 지정된 줄 상단의 박테리아 현탁액에서 몇 방울을 떨어뜨리고 플레이트 끝에 도달할 때까지 아래로 흐르도록 하여 박테리아가 균일하게 퍼지는 데 도움을 줍니다. 플레이트를 평평하게 펴고 배양합니다.

부양하는 동안 각 박테리아는 한천의 영양분을 사용하여 증식하고 개별 콜로니를 형성합니다. 박테리아 현탁액의 희석 증가에 따라 콜로니의 수가 감소합니다. 안구 박테리아 부하를 정량화하기 위해 특정 행의 콜로니 수를 계산합니다.

적절한 실험 종점에서 얼음 위의 눈당 하나의 표지된 고압멸균 수확 튜브에 프로테아제 억제제가 보충된 400마이크로리터의 PBS를 추가하고 감염된 눈의 양쪽에 열린 미세한 끝 겸자를 놓습니다. 팁을 머리 쪽으로 아래로 밀어 눈을 돌려줍니다.

집게가 안구 뒤에 오면 집게를 함께 쥐고 집게를 머리에서 당겨 안구를 분리합니다. 그런 다음 즉시 안구를 적절하게 라벨이 붙은 수확 튜브에 넣습니다. 샘플 수집 후 60분 이내에 닫힌 채취 튜브를 조직 균질화기에 넣고 1분의 균질화 기간 2회 동안 샘플을 균질화하고 그 사이에 30초의 휴식 시간을 둡니다.

균질화 후 샘플을 얼음 위에 놓고 균질화 20마이크로리터 분취량을 사용하여 희석당 180마이크로리터의 PBS로 샘플을 1 x 10에서 음수 8에 도달할 때까지 순차적으로 희석합니다. 다음으로, 예열된 정사각형 BHI 플레이트의 각 행에 적절한 희석 농도로 라벨을 붙이고 플레이트를 45도 각도로 기울인 상태에서 각 희석액 10마이크로리터를 플레이트 상단의 개별 행에 추가합니다. 플레이트를 평평하게 놓기 전에 각 샘플이 플레이트 바닥에 거의 도달할 때까지 실행하십시오. 샘플이 한천에 흡수되면 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터로 옮깁니다. 식민지는 8시간 동안 부화한 후에 보이기 시작해야 합니다.

샘플의 농도를 정확하게 나타내려면 10개에서 100개 사이의 콜로니가 있는 행을 계산하십시오.