돼지 대동맥 내피 세포(pAEC) 분리: 수확된 돼지 복부 대동맥에서 내피 세포를 분리하는 효소 기반 방법

심장에서 신체로 산소가 공급된 혈액을 운반하는 주요 동맥인 대동맥은 내부 내막, 중간 중막 및 외부 외막의 세 가지 층 또는 '튜닉'으로 구성됩니다. 내피 세포 또는 EC는 구조 단백질, 주로 콜라겐으로 구성된 지지 기저막 위에 얇고 연속적인 단층으로 내막에 존재합니다.

EC를 분리하려면 배양 접시에서 수확한 돼지 대동맥으로 시작합니다. 비내피 세포 오염을 방지하기 위해 말단과 주변 부착 조직을 절제합니다. 미생물 성장을 억제하기 위해 항생제가 함유된 완충액으로 대동맥을 세척합니다.

멸균 수술용 봉합사를 대동맥에 통과시키고 한쪽 끝을 묶어 봉합사를 내강 내에 유지합니다. 묶인 끝을 고정하고 봉합사를 집어넣어 대동맥을 완전히 뒤집습니다. 이것은 EC 함유 내막을 효소 소화에 노출시킵니다. 최적의 효소 활성을 위해 미리 데운 저농도 콜라게나제 용액으로 대동맥을 치료하고 배양합니다.

콜라게나제는 EC의 밑에 있는 기저막에 존재하는 콜라겐 단백질을 분해하여 해리를 시작합니다. 배양 후 냉각된 완충액을 첨가하여 콜라게나제 효소를 비활성화합니다.

대동맥 내막 표면을 부드럽게 긁어내고 완충액으로 헹구어 EC를 용액으로 방출합니다. 이 용액을 원심분리하여 EC를 펠릿화합니다. 펠릿을 적절한 매체에 재현탁합니다. 배양 플라스크에 세포 현탁액을 시드하고 배양합니다. EC는 플라스크 바닥에 달라붙어 증식합니다.

돼지 대동맥 내피 세포 분리의 경우, 무균 상태에서 돼지 대동맥을 150mm 페트리 접시로 옮기고 혈관의 양쪽 끝을 부드럽게 제거합니다. 멸균 겸자와 가위를 사용하여 혈관이 고정된 추가 여분의 조직을 다듬고 20-50밀리리터의 신선한 세척 완충액을 사용하여 대동맥의 외부와 내부를 헹굽니다.

다음으로, 대동맥을 통해 수술용 봉합사를 통과시키고 혈관의 한쪽 끝을 느슨하게 묶어 봉합사를 내강 내에 유지합니다. 집게로 묶인 끝 근처의 대동맥을 부드럽게 고정한 다음 수술용 봉합사를 천천히 당겨 대동맥의 내피 표면이 노출될 때까지 대동맥을 역전시

세척당 10밀리리터의 신선한 세척 완충액으로 대동맥의 내피 표면을 세 번 세척하고 대동맥을 15밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 샘플을 섭씨 37도로 데운 0.005% 콜라게나제 IV 소화 용액 10밀리리터로 덮고 조직을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 전체 튜브 내용물을 100mm 배양 접시로 옮기고 10-15ml의 예식 정지 완충액으로 소화를 멈춥니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 혈관 내부 표면에서 대동맥 내피 세포를 부드럽게 제거하고 세척당 5밀리리터의 세척 완충액으로 혈관을 3회 세척합니다.

마지막 세척 후, 상청액을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 세척당 5밀리리터의 신선한 세척 완충액으로 배양 접시 바닥을 2회 세척하고 세척액을 50밀리미터 튜브에 모아줍니다.

원심분리로 세포를 수집하고 마지막 10밀리리터의 상층액을 제외한 모든 것을 버립니다. 20밀리리터의 세척 완충액을 첨가하여 기포를 피하도록 주의하면서 펠릿을 재현탁하고 또 다른 원심분리로 세포를 수집합니다.

계수를 위해 펠릿을 1밀리리터의 세포 배양 배지에 재현탁하고 25센티미터 제곱 플라스크 농도당 6개 세포에 1 x 10으로 세포를 플레이트합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 세포 배양 인큐베이터에 넣고 2-3일마다 배지를 새로 고칩니다.