JoVE 실험 백과사전
생물학적 기술
0 조회수 • 3:47 분 • July 8th, 2025
불멸화된 조혈 줄기 및 전구 세포인 iHSPC, 특정 스테로이드 호르몬 및 조혈 사이토카인을 함유한 배지에서 배양하여 미분화 상태에서 세포 증식을 조절하는 것으로 시작합니다. 적절한 양이온성 중합체와 렌티바이러스 벡터를 추가합니다.
재조합 바이러스는 특정 숙주 유전자와 항생제 내성 마커 유전자를 향한 짧은 헤어핀 RNA, shRNA에 대한 코딩 서열을 전달합니다.
침전된 세포와 바이러스로 원심분리합니다. 배양하는 동안 양이온성 중합체는 세포막 전하를 중화하여 바이러스 결합을 강화합니다. 막 융합 후 바이러스 유전 물질과 효소가 세포 세포질로 방출됩니다. 바이러스 게놈은 역전사되어 핵으로 이동하고 숙주 게놈에 통합됩니다.
상기 구축물에서 특정 프로모터의 영향 하에서, 표적 mRNA 매칭 서열, 루프 세그먼트 및 제1에 상보적인 또 다른 서열을 포함하는 shRNA 유전자 구축물은 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드의 루프 세그먼트를 갖는 shRNA를 형성하여 전사된다. 전사 후 shRNA는 세포질로 내보내집니다.
특정 리보뉴클레아제가 루프 세그먼트를 절단하여 이중 가닥 RNA, siRNA를 형성합니다. siRNA는 RNA 유도 침묵 복합체, RISC 및 siRNA 가닥에 통합됩니다. 표적 mRNA에 상보적인 유지된 가닥을 갖는 활성화된 복합체는 서열 특이적 방식으로 표적 mRNA를 인식하고 결합하여 발현을 음으로 조절하고 표적 유전자 억제를 매개합니다.
특정 항생제와 함께 세포를 배양합니다. 안정적으로 형질도입된 세포는 항생제 내성 유전자를 발현하여 선택을 가능하게 합니다. 배지를 새로 고치고 배양하여 안정적으로 형질도입된 세포의 증식을 허용합니다.
시작하려면 불멸화된 조혈 줄기 및 전구 세포 또는 iHSPC를 밀리리터당 100나노그램의 Flt3 리간드와 1마이크로몰 베타-에스트라디올이 보충된 완전한 RPMI 1640 배지에 유지합니다. 렌티바이러스 형질도입의 경우, 웰당 1 x 105 세포의 밀도와 Flt3 리간드, 베타-에스트라디올 및 폴리브렌을 포함하는 1밀리리터의 완전 배지로 iHSPC를 12웰 플레이트에 플레이트합니다.
그런 다음 각 웰에 짧은 헤어핀 RNA를 운반하는 렌티바이러스를 100의 감염 다중도로 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 1,100 x g 및 섭씨 37도에서 90분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 감염된 세포를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 세포를 15밀리리터 튜브에 모으고 원심분리
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요