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생물학적 기술
0 조회수 • 5:12 분 • July 8th, 2025
튜브에 존재하는 면역 세포에 올인원 CRISPR 플라스미드를 추가하는 것으로 시작합니다. 이 플라스미드는 숙주 게놈의 표적 서열에 상보적인 sgRNA 또는 단일 가이드 RNA 암호화 서열과 결합된 Cas9 유전자를 포함합니다.
상동 암 또는 HA 사이에 끼워진 이식유전자를 포함하는 선형화된 기증자 플라스미드를 추가합니다 - 상동 재조합에 필요한 DNA 반복입니다. 전류를 사용하여 플라스미드 혼합물을 세포에 주입하는 전기천공을 수행합니다. 일단 내부로 들어가면 처리된 sgRNA는 발현된 Cas9 뉴클레아제와 복합체를 형성합니다.
sgRNA는 표적 부위에 결합하여 Cas9 뉴클레아제가 프로토스페이서 인접 모티프 또는 PAM으로 알려진 특정 인식 서열을 식별하고 그 근처의 숙주 DNA를 절단할 수 있도록 합니다. 이것은 세포 기계가 DNA를 절제하는 곳에 뭉툭한 이중 가닥 절단을 생성하여 3' 돌출부를 생성합니다. HA 측면 부위의 존재는 절단된 DNA가 HA 서열에 합류하여 이종 이중 구조인 D-루프를 형성하는 상동성 지향 복구 메커니즘을 유발합니다.
DNA 합성은 계속되어 원래의 DNA 가닥에 다시 합류할 때까지 이식유전자 서열에 상보적인 가닥을 형성합니다. D-루프의 상단은 DNA의 누락된 부분을 합성하는 주형 역할을 하여 4개의 DNA 가닥이 상호 작용하는 구조인 이중 홀리데이 접합을 생성합니다. 이러한 접합부는 해결되고 간격이 복구되어 표적 유전자 삽입을 촉진합니다.
각 웰에 항생제 없이 500마이크로리터의 완전 성장 배지가 포함된 24웰 플레이트를 준비합니다. 가습된 37도 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 플레이트를 예열합니다. 전기천공 시스템을 켭니다. JURKAT 또는 RAW 셀에 대한 입력 전기천공 매개변수.
전기천공을 위해 세포-DNA 혼합물을 준비합니다. 25제곱센티미터 플라스크에 JURKAT 세포 배양액을 수집합니다. 세포를 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 실온에서 8분 동안 90 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
상청액의 경우 세척을 위해 세포를 5mL DPBS로 재현탁합니다. 그런 다음 이전 단계와 동일한 조건을 사용하여 원심분리에 의해 세포 현탁액을 회전시킵니다. DPBS를 제거하고 2mL의 DPBS를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 사용하고 같은 부피의 0.2% 트리판 블루와 혼합합니다.
세포 수를 추정하려면 이 계수 슬라이드에 샘플을 로드합니다. 자동 세포 계수기에 계수 슬라이드를 삽입하고 세포 이미지를 본 다음 세포 계수 결과를 얻습니다. 녹인 실험당 전기천공을 5회 반복하는 동안 200만 개의 세포를 계산합니다.
필요한 수의 세포를 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 원심분리에 의한 펠릿 세포. 시간을 절약하기 위해 원심분리 단계에서 전기천공 혼합물을 준비할 수 있습니다. CRISPR-Cas9 벡터 각각 2.5마이크로그램, 선형화된 표적화 벡터 2.4마이크로그램, 재현탁액 버퍼 R을 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브에 총 부피 55마이크로리터에 첨가합니다.
부드럽게 소용돌이치고 잠시 회전시켜 잘 섞습니다. 사용하기 전에 전기천공 혼합물을 실온에 두십시오. 회전 후 DPBS를 흡인한 다음 추가로 30초 동안 원심분리합니다. 가능한 한 많은 상청액을 제거하십시오. 준비된 전기천공 혼합물을 첨가하여 세포를 재현탁합니다. 부드럽게 위아래로 피펫팅합니다.
전기천공: 세포 전기천공 혼합물의 경우 피펫과 함께 10마이크로리터 핵관 팁을 사용합니다.
중요: 피펫팅 중 기포가 생기면 전기천공 실패가 발생할 수 있습니다. "시작"을 누릅니다.
전기천공 후, 예열된 성장 배지가 있는 24웰 플레이트의 한 웰에 샘플을 옮깁니다. 나머지 4개의 반복 샘플에 대해 위와 동일한 전기천공 절차를 수행합니다. 세포가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. FACS 세포 분류 전에 37도 인큐베이터에서 48-72시간 동안 세포를 배양합니다.