0 조회수 • 4:34 분 • July 8th, 2025
작은 간섭 RNA 또는 이중 가닥 RNA의 일종인 siRNA를 비부착 지방 세포 또는 지방 세포로 역형질감염하려면 지방 세포에서 특정 단백질 암호화 유전자를 표적으로 하는 siRNA의 현탁액을 준비합니다. 적절한 양이온성 지질 기반 형질감염 시약을 추가합니다. 혼합물을 배양하여 정전기 상호 작용을 통해 형질감염 복합체를 형성합니다.
혼합물을 멀티웰 플레이트의 콜라겐 코팅 웰로 옮깁니다. 형질감염 복합체는 비특이적 상호 작용에 의해 플레이트 코팅에 고정됩니다. 고정화된 형질감염 복합체가 포함된 웰에 지방세포의 현탁액을 피펫팅합니다. 지방세포는 플레이트 코팅에 느슨하게 부착되어 세포와 복합체 사이의 물리적 접촉을 증가시킵니다.
형질감염 복합체는 세포막에 융합되어 siRNA를 세포질로 전달합니다. 표적 mRNA에 대한 상보적 서열을 갖는 안티센스 가닥과 센스 가닥으로 구성된 siRNA는 다중 단백질 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)에 의해 인식됩니다. siRNA는 RISC에 결합하고 가닥은 분리되며 안티센스 가닥은 복합체에 결합된 상태로 유지됩니다.
활성화된 siRNA-RISC 복합체는 표적 mRNA의 상보적 부위를 인식하고 결합합니다. 이것은 RISC 복합체의 아르고노트 단백질에 의한 mRNA의 서열 특이적 절단으로 이어집니다. 절단된 mRNA는 세포 기계에 의해 추가로 분해되어 표적 유전자 발현을 침묵시킵니다.
혼합할 개선된 최소 필수 배지로 siRNA를 피펫팅하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 형질감염 시약과 개선된 최소 필수 배지를 siRNA에 추가하고 피펫으로 혼합합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 형질감염 혼합물을 추가합니다.
100mm 페트리 접시에서 세포를 DPBS로 두 번 세척합니다. 세포에 5X 트립신을 첨가하고 전체 표면을 트립신으로 덮도록 합니다. 30초 동안 기다렸다가 트립신을 조심스럽게 제거합니다. 페트리 접시를 인큐베이터에서 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
그런 다음 접시를 두드려 세포를 분리하여 세포 손상을 방지합니다. 트립신을 중화시키기 위해 피루브산, 25mM 포도당 25mM, FCS 10%, 페니실린 및 스트렙토마이신 1%가 없는 DMEM 10밀리리터를 첨가합니다. 배지를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화합니다.
Malassez 계수 챔버 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 세포의 농도를 6.25 x 105 세포/mL 배지로 조정합니다. 12웰 플레이트의 웰당 800마이크로리터의 세포 현탁액 또는 형질감염 혼합물을 포함하는 24웰 플레이트의 웰당 400마이크로리터의 세포 현탁액을 시드합니다.
플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 배양하고 24시간 동안 방해하지 마십시오. 다음날, 상청액을 피루브산염, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 없는 신선한 DMEM으로 조심스럽게 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.