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생물학적 기술
0 조회수 • 5:40 분 • July 8th, 2025
미세 사출 금형의 웰에 넣은 생존 가능한 1세포 단계 제브라피쉬 배아로 시작합니다.
미세주입 바늘에 Tol2 트랜스포자제-암호화 mRNA 및 트랜스포존 공여체 플라스미드가 포함된 용액을 로드합니다. 플라스미드는 유비쿼터스 제브라피쉬 프로모터와 Tol2 트랜스포존 팔 옆에 있는 형광 단백질 암호화 유전자로 구성됩니다.
미세 주입 용액을 제브라피쉬 배아의 세포질에 조심스럽게 주입합니다. 세포 내에서 Tol2 전이효소 mRNA는 Tol2 전이효소 단백질로 번역되어 핵으로 활발하게 운반됩니다.
기증자 플라스미드의 Tol2 부위는 리포터 유전자 옆에 있는 특정 거꾸로 된 말단 반복 또는 ITR을 포함합니다. ITR은 짧고 직접적인 반복으로 옆에 있습니다. 전제효소 단백질은 ITR 부위를 인식하고 결합하여 측면 DNA에 헤어핀을 형성합니다. 트랜스포타제는 측면 DNA에서 트랜스포존 구조물을 추가로 절단하여 플라스미드에서 방출하고 짧고 직접적인 반복을 남깁니다.
트랜스포타제는 체세포 게놈에 엇갈린 이중 가닥 절단을 생성하고 트랜스포존 구조물을 게놈 부위에 삽입합니다. DNA 중합효소에 의한 엇갈린 말단의 간격 채우기 후 닉의 결찰은 짧고 직접적인 반복을 생성합니다.
결찰은 체세포 게놈에 안정적인 트랜스포존 구조물 통합을 유발하고 프로모터는 형광 단백질 발현을 촉진합니다. 주입된 배아를 배양합니다. 배아 발달 과정에서 체세포는 다양한 세포 유형을 생성하고 형질전환 제브라피시를 생성합니다.
Tol2 전위 효소 mRNA와 주사 용액을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 주사 전 오후에 최소 2마리의 수컷과 2마리의 암컷이 있는 4-6개의 번식 탱크를 설치했습니다. 물고기 배설물의 양을 줄이고 번식 반응을 유도하려면 오후에 물고기에게 먹이를 주는 것을 피하십시오.
다음날 아침, 영하 80도의 냉동고에서 준비된 주입액을 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 물고기 사육 수조의 칸막이를 당기고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 일반적으로 물고기는 20분에서 30분 이내에 알을 낳습니다.
기다리는 동안 다음 매개변수가 있는 마이크로피펫 풀러를 사용하여 모세관 유리에서 바늘을 당깁니다. 실험실 물티슈를 사용하여 바늘 끝을 부수고 경사진 가장자리를 만듭니다. 배아 사망률을 줄이기 위해 더 작은 직경이 선호됩니다.
물고기가 알을 낳으면 직경 10cm의 페트리 접시에 모으십시오. 해부 현미경 바로 아래에서 모든 비정상적인 배아와 물고기 배설물
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