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생물학적 기술
0 조회수 • 3:29 분 • July 8th, 2025
적절한 전기천공 완충액에 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 현탁시키는 것으로 시작합니다. PiggyBac 트랜스포자제 암호화 플라스미드와 기증자 플라스미드로 구성된 용액을 추가합니다. 혼합물을 전기 천공합니다.
전기 펄스는 일시적으로 세포막을 투과시켜 세포의 플라스미드 흡수를 촉진합니다. 기증자 플라스미드는 트랜스포존 특이적 거꾸로 된 말단 반복(ITR)을 포함하며, 이는 서로 거꾸로 보완되어 표적 단백질 및 항생제 내성 유전자를 둘러싸는 TTAA 반복이 옆에 있습니다.
발현된 PiggyBac 전위 효소 단백질은 TTAA 반복 내부의 ITR의 3' 말단에 흠집을 생성합니다. 노출된 3'-수산기는 측면 DNA 내부의 상보적 가닥의 뉴클레오티드를 공격하여 트랜스포존 말단에 TTAA 헤어핀을 형성하여 플라스미드에서 트랜스포존 구조물을 방출합니다.
트랜스포자제는 헤어핀을 분해하여 트랜스포존 구조의 5' 끝에 TTAA 돌출부를 형성합니다. 트랜스포타제는 숙주 게놈의 TTAA 서열에서 이중 가닥 절단을 추가로 생성합니다. 방출된 3'-하이드록실 트랜스포존 말단은 엇갈린 말단에서 TTAA 서열을 공격하여 트랜스포존 구조체가 숙주 게놈에 공유 결합되어 트랜스포존 구조물 측면에 단일 가닥 간격을 남깁니다. 숙주 DNA의 이러한 간격은 결찰되어 트랜스포존 구조의 안정적인 통합으로 이어집니다.
세포외 기질 단백질 코팅 플레이트에 시딩된 hiPSC를 항생제 함유 배지로 처리합니다. 업스트림 프로모터에 의해 구동되는 항생제 내성 유전자는 유전자 편집 세포의 선택을 가능하게 합니다.
세포를 섭씨 37도에서 5-10분 동안 세포 해리 시약으로 처리하기 전에 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS로 인간 iPSC 배양액을 헹굽니다. 세포가 배양 용기에서 분리되기 시작하면 P1000 피펫을 사용하여 세포를 3-4회 부드럽게 수동으로 해리합니다.
세포를 15밀리리터 튜브로 옮기고 칼슘과 마그네슘이 없는 신선한 PBS로 최종 부피를 최대 10밀리리터로 가져와 계수합니다. 원심분리에 의해 1 x 106 세포를 수집하고 전기천공 키트에서 100마이크로리터의 완충액 R에 펠릿을 재현탁합니다.
형질감염을 위해 4.5마이크로그램의 전위성 벡터 플라스미드 DNA와 0.5마이크로그램의 PiggyBac 전이효소 플라스미드 DNA를 추가합니다. 표시된 매개변수와 함께 제조업체의 지침에 따라 세포 전기천공 시스템으로 형질감염합니다. 그러면. 6mm 매트릭스 코팅
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