부착 배양 세포에 핵산을 도입하기 위한 비드 로딩: 부착 포유류 세포에 형광 단백질 인코딩 플라스미드를 적재하는 기술

배양 플레이트에서 부착된 포유류 세포의 배양으로 시작합니다. 멸균된 알칼리 처리된 미크론 크기의 유리 구슬을 맞춤형 구슬 로더 장치의 챔버로 옮깁니다. 적재 중에 비드가 통과할 수 있도록 최적의 크기의 개구부가 있는 메쉬를 사용하여 챔버 개구부를 덮습니다. 이미징 챔버 어셈블리로 메쉬를 고정합니다.

플레이트에서 미디어를 제거합니다. 형광 리포터 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA의 현탁액을 플레이트에 피펫팅하여 세포에 고르게 분포시킵니다. 비드 로더 장치를 사용하여 유리 구슬의 단층을 셀 위에 부드럽게 분산시킵니다. 적절한 힘으로 배양 플레이트를 짧게 두드립니다.

유리 구슬은 부착된 세포 위에서 잠시 굴러가는 반면, 알칼리 처리는 세포에 덜 부착됩니다. 비드와 세포 사이의 충돌의 영향은 적절한 변형을 전달하여 세포막에 국부적인 파괴를 생성합니다. 이렇게 형성된 작은 치수의 일시적인 기공은 큰 비드의 유입을 방지하면서 플라스미드 DNA의 세포 흡수를 촉진합니다.

회복 기간 동안 세포막이 다시 밀봉되어 막 무결성을 회복하고 플라스미드 DNA를 포획합니다. 플레이트에 매체를 추가하고 플레이트에서 눈에 보이는 떠다니는 비드를 조심스럽게 흡인합니다. 플레이트를 배양합니다.

플라스미드 DNA를 포함하는 성공적으로 형질감염된 세포는 형광 현미경으로 시각화할 수 있는 형광 리포터 단백질을 발현합니다.

세포에서 배지를 제거하고 챔버 가장자리 주변에서 모든 배지를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 챔버를 약 45도 각도로 기울이고 중앙 마이크로웰에 남아 있는 배지 방울을 제거합니다. 비드 로딩 용액을 챔버 중앙에 있는 유리 마이크로웰에 부드럽게 피펫팅합니다.

비드 로딩 장치를 사용하여 셀 위에 유리 비드의 단층을 부드럽게 분산시킵니다. 비드가 세포를 완전히 덮고 있는지 확인하십시오. 두 손가락으로 챔버를 꼬집습니다. 약 2인치 정도 들어 올려 그 높이에서 접시를 떨어뜨리는 것과 거의 같은 힘을 사용하여 단단히 내립니다.

챔버의 플라스틱 쪽에 천천히 피펫팅하여 배지를 챔버에 부드럽게 다시 추가합니다. 세포를 방해하지 않고 떠다니는 구슬을 흡인합니다. 전체 비드 로딩 절차는 비교적 빠르게 수행되어야 배지가 없을 때 세포가 건조되지 않습니다. 그런 다음 인큐베이터에서 0.5-2시간 동안 세포를 배양합니다.