Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation: 유전자 조작 Agrobacterium tumefaciens를 통해 쌀 게놈을 유전적으로 변형시키는 방법

식물 병원성 박테리아인 Agrobacterium tumefaciens는 인공적으로 제조된 Ti 플라스미드를 도입하여 전달 DNA 또는 T-DNA 영역에 관심 유전자를 운반하고, T-DNA를 식물 세포로 전달하기 위해 독성 또는 Vir 유전자를 운반하는 도우미 플라스미드를 도입하여 유전자 조작할 수 있습니다.

아그로박테리움 매개 유전적 형질전환의 경우 어린 벼 꽃차례부터 시작하여 작은 조각으로 자릅니다. 절단을 성장 배지로 옮기고 배양하여 절단이 굳은살이라고 하는 미분화 세포 덩어리로 성장하는 것을 촉진합니다.

이제 굳은살을 아그로박테리움의 화학유인제인 아세토시린곤이 함유된 아그로박테리움 침윤 배지로 옮깁니다. 다음으로, 유전자 조작 아그로박테리움 배양액을 배지에 첨가하고 잠시 배양합니다.

아세토시린곤 분자는 아그로박테리움 막의 세포 수용체 단백질인 VirA를 활성화하여 전사 활성화제 단백질인 VirG의 인산화를 추가로 매개합니다. 인산화된 VirG는 헬퍼 플라스미드를 향해 이동하여 채널 단백질 및 엔도뉴클레아제(VirD1 및 VirD2)를 포함한 독성 유전자의 캐스케이드 전사를 활성화합니다.

채널 단백질은 박테리아와 식물 세포를 연결하는 수송 채널을 형성하는 반면, 엔도뉴클레아제는 Ti 플라스미드의 경계 서열에 결합하여 한쪽 끝에 결합된 VirD2로 T-DNA를 절단합니다. 그 후, VirD2는 수송 채널을 통해 굳은살 세포로 T-DNA의 진입을 지시하고 쌀 게놈으로의 통합을 촉진합니다.

각 꽃차례를 70% 알코올 면봉으로 닦고 자르기 전에 건조시킵니다. 꽃차례를 멸균 실험실로 가져와 멸균된 가위로 작은 조각으로 자릅니다. 그런 다음 절단을 NBD2 배지가 들어 있는 페트리 플레이트로 옮깁니다.

를 섭씨 26도의 어두운 곳에서 10-14일 동안 배양하여 굳은살을 유도합니다. 형질전환을 수행하려면 선택적 항생제가 포함된 YEB 플레이트에서 50밀리리터 원뿔형 멸균 시험관에서 동일한 항생제를 함유한 액체 YEB 배지 5밀리리터로 단일 콜로니를 옮깁니다. 박테리아가 OD₆₀₀ 0.5로 자랄 때까지 250 x g 및 섭씨 25-28도에서 오비탈 셰이커에서 튜브를 흔듭니다.

250밀리리터 원뿔형 플라스크에 동일한 선택적 항생제가 포함된 YEB 배지 100밀리리터에 박테리아 현탁액 1밀리리터를 첨가하고, 오비탈 쉐이커에서 플라스크를 250 x g, 섭씨 28도에서 4시간 동안 흔든다. 박테리아를 수집하기 위해 박테리아를 수집하기 위해 실온에서 10분 동안 배양물을 4,000 x g으로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠릿을 AAM-AS 배지로 재현탁하고 현탁액을 OD₆₀₀ 0.4로 희석합니다.

배양 후, 약 150개의 건강한 연한 노란색 배아 발생 굳은살을 150밀리리터 멸균 플라스크에 수집합니다. 플라스크에 50 내지 75밀리리터의 박테리아 세포 현탁액을 첨가한 다음 10 내지 25밀리리터의 신선한 AAM-AS 배지를 첨가하여 가끔 흔들면서 굳은살을 10 내지 20분 동안 담급니다.

플라스크에서 박테리아 현탁액을 조심스럽게 붓고 멸균 여과지로 굳은살을 말리십시오. 그런 다음 NBD-AS 배지가 있는 페트리 접시 위에 놓고 여과지로 덮습니다. 질리를 섭씨 25도에서 28도의 어둠 속에서 3일 동안 배양하고 박테리아가 과도하게 증식하는지 확인합니다.

3일간의 공동 배양 후, 과지를 사용하여 캘리를 멸균 페트리 접시로 옮긴 다음 깨끗한 벤치에서 2시간 동안 자연 건조시킵니다. 굳은살이 여과지에 달라붙지 않았는지 확인하고 1차 선택 배지 NBD2로 옮깁니다.

2주 후, 굳은살을 신선한 선택 배지가 들어 있는 새 접시에 고르게 옮깁니다. 그런 다음 분화를 위해 굳은살을 신선한 MS 배지로 옮기고 새싹 새싹을 MS 배지(10mg/L 하이그로마이신 포함)로 이동하여 더 많은 새싹을 증식시킵니다.