0 조회수 • 3:59 분 • July 8th, 2025
일차 신경 세포로 전기천공 기반 플라스미드 DNA 전달을 위해서는 적절한 전기천공 배지에 세포를 현탁시키는 것으로 시작합니다. 형광 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA를 첨가하여 전기천공 혼합물을 준비합니다.
전기천공 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 기포를 피하면서 전기천공 혼합물을 전기천공 큐벳으로 부드럽게 옮깁니다. 큐벳을 전기천공기의 큐벳 홀더로 옮깁니다. 전기천공 매개변수를 설정합니다. 전기천공을 시작합니다.
세포막을 가로질러 가해지는 고전압 짧은 전기 펄스는 막의 양쪽에 차등 전하 축적을 일으켜 세포막을 가로지르는 전압인 막관통 전위를 증가시킵니다.
유도된 막관통 전위가 지질 이중층 파괴 전위를 초과하면 지질 이중층은 국부적인 구성 변화와 함께 불안정해져 세포막에 일시적인 친수성 기공을 형성합니다. 적절한 크기의 기공은 플라스미드 DNA가 세포질로 들어갈 수 있는 경로를 제공합니다.
전기천공이 완료되면 지질 이중층이 다시 밀봉되어 세포막 이중층 무결성을 회복하여 플라스미드 DNA를 포획합니다. 또한, 핵을 둘러싼 이중막인 핵막이 분해되는 세포주기 단계에서 플라스미드 DNA가 핵으로 전위됩니다.
전기천공된 세포를 단백질로 코팅된 커버슬립이 있는 멀티웰 플레이트의 배지 함유 웰에 도금합니다. 세포가 단백질로 코팅된 커버슬립에 부착될 수 있도록 배양합니다. 플라스미드 DNA를 포함하는 성공적으로 형질감염된 세포는 형광 단백질을 발현합니다.
시작하려면 코팅된 커버슬립이 포함된 24웰 배양 플레이트의 각 벽에 0.5밀리리터의 배양 배지를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 따뜻하게 유지합니다. 필요한 수의 세포를 멸균 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 실온에서 5분 동안 200 x g으로 회전시킵니다.
상청액을 버리고 세포 펠릿을 200마이크로리터의 Opti-MEM에 재현탁합니다. 이 절차를 두 번 반복하여 튜브에 잔류 배양 배지가 없는지 확인합니다. 나열된 대로 전기천공 매개변수를 설정합니다. 전기천공 반응을 부드럽게 피펫팅하여 잘 혼합하고 긴 P200 피펫 팁을 사용하여 정확한 부피의 혼합물 100마이크로리터를 2mm 갭 큐벳으로 옮깁니다.
큐벳이 큐벳 챔버 내부에 들어가면 전기천공기의 오메가 버튼을 누르고 100마이크로리터의 정확한 부피를 준수하여 임피던스 값을 기록합니다. 임피던스 값의 범위는 약 30과 35여야 합니다.
시작 버튼을 눌러 펄스를 시작합니다. 판독 프레임에 표시된 측정된 전류 값과 보석을 기록합니다. 챔버에서 큐벳을 제거합니다.
예열된 배양 배지 100마이크로리터를 큐벳에 즉시 넣고 위아래로 2-3회 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포 현탁액을 이전에 준비한 24웰 플레이트로 즉시 옮깁니다. 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다.