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생물학적 기술
0 조회수 • 3:31 분 • July 8th, 2025
레이저 보조 렌티바이러스 유전자 전달은 이식유전자를 숙주 시스템으로 전달하는 기술입니다.
형질전환 마우스를 생산하려면 적절한 배양 배지에서 분리된 마우스 수정란으로 시작합니다. 수정란 함유 배양 접시를 레이저 장치가 사전 설치되고 제어 소프트웨어에 부착된 현미경 스테이지에 놓습니다. 적절한 배율로 관찰하십시오.
수정란은 렌티바이러스 입자를 차단하는 보호 당단백질층인 투명대(zona pellucida)로 둘러싸여 있습니다. 이 장벽을 투과하려면 레이저 장치를 켜고 투명대 위로 레이저 LED가 보이는지 확인하십시오. 제어 소프트웨어를 사용하여 레이저를 발사합니다. 원하는 천공 직경에 따라 발사 시간을 조정하십시오.
회복을 위해 계란을 인큐베이터에 넣으십시오. 짧은 배양 후, 알을 제거하고 관심 유전자와 형광 선택 가능한 마커를 운반하는 렌티바이러스 입자를 추가합니다.
투명대가 천공되면 렌티바이러스는 난세포막을 향해 쉽게 확산되어 엔도사이토시스를 통해 들어갑니다. 렌티바이러스는 분해되어 RNA를 방출하며, RNA는 이중 가닥 DNA로 순차적으로 처리될 때 숙주 핵으로 들어가 외래 유전자를 숙주 게놈에 통합합니다.
알을 부화시키고 배반포로 발달하도록 합니다. 배반포를 짝짓기 암컷 마우스에 이식합니다. 임신이 완료되면 새끼를 회수하고 이식유전자 존재를 분석합니다.
계란이 인큐베이터에 있는 동안 제조업체의 권장 사항에 따라 XYClone 레이저를 설정하고 보정합니다. 알이 준비되면 첫 번째 드롭 플레이트를 레이저 현미경 스테이지에 놓고 투명대에 수동으로 초점을 맞춥니다. 대물렌즈를 통해 레이저 LED 광이 보이는지 확인한 후 현미경 스테이지를 움직여 LED 레이저로 영역을 대상으로 하고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 XYClone 레이저를 250마이크로초로 설정합니다.
LED 조명 크기를 적절한 치수로 조정하고 레이저로 각 계란의 투명대를 세 번 천공하여 10마이크로미터 구멍 3개를 만듭니다.
수정란은 15분 이상 인큐베이터 밖에 있을 수 없으므로 천공을 빠르고 조심스럽게 수행하는 것이 중요합니다.
그런 다음 천공된 계란을 인큐베이터에 다시 2시간 더 넣습니다. 두 번째 배양이 끝나면 50마이크로리터 KSOM 방울을 혼합하지 않고 2마이크로리터의 농축 렌티바이러스로 처리하고 계란을 인큐베이터에 4일 동안 되돌립니다. 난자가 배반포로 발달하면 비수술적 배아 이식 장치를 사용하여 약 10-15개의 배아를 KSOM과 약 2마이크로리터에 증착합니다.
배아 이식 후 17일 후 임신한 쥐가 자연 분만하도록 하거나 필요에 따라 제왕절개로 신생아를 채취합니다.