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생물학적 기술
0 조회수 • 3:10 분 • July 8th, 2025
혈관 평활근 세포(VSMC)는 혈관벽의 중간층인 중막막에서 눈에 띄는 세포 구성 요소입니다. 병리학적 단서나 노화에 대한 반응으로 이 세포는 세포외 기질에 칼슘이 축적되는 현상인 혈관 석회화를 매개합니다.
사전 석회화된 쥐 대동맥 VSMC 배양의 부착층이 포함된 멀티웰 플레이트를 취하십시오. 세포를 포르말린 용액과 함께 배양하여 세포 단백질을 가교하고 염색하기 전에 VSMC 구조를 안정화합니다.
우물에서 포르말린을 흡인하고 질산은 용액을 첨가하여 폰 코사 염색을 시작합니다. 적절한 광원 아래에서 플레이트를 배양합니다.
질산은 용액이 VSMC 층의 세포외 기질의 석회화 부위에 도달하면 은 이온이 인산염에 결합된 칼슘 이온을 대체합니다. 이로 인해 일시적인 노란색이 발생합니다. 유기물과 빛이 있는 경우 인산은의 광화학적 분해로 인해 검은색 금속은이 형성됩니다.
사용한 질산은 용액의 최대량을 버리십시오. 티오황산나트륨 용액으로 세포를 처리합니다. 이 용액은 잔류 은염을 수용성 복합체로 전환하여 최종 물로 헹구어 제거할 수 있어 염색 대비를 향상시킵니다.
염색된 세포를 이미지화하여 석회화를 나타내는 불용성 검은색 침전물을 찾습니다.
혈관 평활근 세포에 석회화를 유도하려면 세포를 6웰 배양판으로 옮기고 부착시킵니다. 다음으로, 석회화 배지에 세포를 다시 공급합니다. 세포를 섭씨 37도에서 최소 7일 동안 배양합니다. 그런 다음 세포 배양 플레이트에서 배지를 흡인합니다. 탈이온수로 세포를 한 번 세척합니다.
세포를 실온에서 10% 포르말린 1밀리리터에 20분 동안 넣어 고정합니다. 그런 다음 포르말린을 제거하고 고정된 세포를 증류수로 5분 동안 세척합니다.
다음으로, 60 내지 100와트 전구 아래에서 5% 질산은 용액 1밀리리터에서 세포를 1 내지 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 질산은 용액을 흡인하고 증류수로 5분 동안 세척합니다. 5분 후, 증류수에 5분 동안 5% 티오황산나트륨 용액 1밀리리터에 세포를 넣어 반응하지 않은 은을 제거합니다. 그런 다음 세포를 증류수로 5분 동안 헹굽니다. von Kossa로 염색된 세포는 이제 표준 도광 현미경으로 이미징할 준비가 되었습니다.