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생물학적 기술
0 조회수 • 4:33 분 • July 8th, 2025
암 전이 동안 원발성 종양의 종양 세포는 순환계를 통해 이동하여 먼 장기로 혈관을 유출하여 이차 종양을 형성합니다.
고도 전이성 유방암 세포인 4T1 세포를 주입한 유방암 마우스 모델에서 폐 전이를 평가하기 위해, 수확된 폐에서 분리된 4T1 세포를 포함한 세포 현탁액을 준비한다. 현탁액을 원심분리하고 6-티오구아닌, 6-TG(구아닌 유사체)를 포함하는 배지에 세포를 재현탁합니다. 배양 플레이트에 세포 현탁액을 시드합니다.
6TG는 특정 트랜스퍼라제 효소가 독성 뉴클레오티드인 6-TG 뉴클레오티드로 전환하는 정상 세포로 들어갑니다. 이러한 세포독성 뉴클레오티드는 DNA에 통합되어 DNA 손상을 일으키고 배양에서 세포를 선택적으로 제거합니다. 4T1 세포는 독성 뉴클레오티드를 형성하는 능력이 감소하여 생존과 플레이트 부착을 촉진합니다. 세포의 증식 능력에 따라 콜로니를 형성합니다.
메탄올로 세포를 처리하십시오. 메탄올은 세포를 투과화하고 세포 단백질을 변성시킵니다. 세포를 메틸렌 블루와 함께 배양합니다.
양전하를 띤 염료는 세포에 들어가 음전하를 띤 DNA와 상호 작용하여 DNA 가닥의 인접한 염기쌍 사이의 공간으로 삽입됩니다. 또한 세포질의 RNA에 결합하지만 친화력은 낮습니다. 핵은 낮은 RNA 농도로 인해 세포질보다 DNA 농도가 높기 때문에 진한 파란색으로 염색됩니다. 전이성 콜로니는 파란색 점으로 나타납니다.
플레이트를 이미지화합니다. 소프트웨어를 사용하여 전이성 콜로니를 결정하고 마우스 폐의 전이성 부담을 정량화합니다.
1X HBSS로 튜브의 부피를 최대 10밀리리터까지 가져옵니다. 그런 다음 내용물을 70마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 50밀리리터 원추형 튜브에 붓습니다. 1밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 샘플을 부드럽게 분쇄합니다.
튜브를 350배g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버립니다. 그런 다음 10밀리리터의 1X HBSS로 펠릿을 두 번 세척합니다. 펠릿을 60마이크로몰 6-티오구아닌 완전 배양 배지 10밀리리터에 재현탁하고 원하는 경우 희석 방식을 사용하여 10센티미터 세포 배양 플레이트에 샘플을 도금합니다.
플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 5일 동안 배양합니다. 플레이트에서 배양 배지를 적절한 폐기물 용기에 붓습니다. 세포를 고정하려면 각 플레이트에 희석되지 않은 메탄올 5밀리리터를 넣고 실온에서 5분 동안 배양하면서 메탄올이 플레이트 전체를 덮도록 소용돌이치
도록 합니다.접시에서 메탄올을 적절한 폐기물 용기에 부은 다음 각 접시를 증류수 5밀리리터로 헹굽니다. 플레이트당 0.03% 메틸렌 블루 5밀리리터를 넣고 실온에서 5분 동안 배양한 후 메틸렌 블루 용액을 휘젓고 플레이트 전체를 덮도록 합니다. 메틸렌 블루를 적절한 폐기물 용기에 붓고 각 접시를 증류수 5밀리리터로 다시 헹굽니다.
접시를 거꾸로 뒤집어 종이 타월에 닦아 여분의 액체를 제거합니다. 접시를 뚜껑에 놓고 밤새 자연 건조시킵니다. 전이성 콜로니는 파란색이 됩니다. 접시가 건조되면 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.