JoVE 실험 백과사전
생물학적 기술
0 조회수 • 3:08 분 • July 8th, 2025
파골세포는 뼈 표면에서 발견되는 큰 돔 모양의 다핵 세포입니다. 이 세포에는 주석산염 내성 산성 포스파타제(TRAP)가 풍부한 수많은 세포질 과립이 포함되어 있습니다. 이 효소는 세포외 기질을 소화하고 미네랄 결정을 용해시켜 뼈 흡수를 촉진합니다.
파골세포의 세포화학적 마커로서 TRAP 과립을 검출하려면 부착된 파골세포가 포함된 배양 접시를 가져 가십시오. 세포에 TRAP 염색 용액을 첨가합니다. 이 용액은 디아조늄염이 보충된 완충액 내의 인산염 함유 나프톨 유도체 및 타르타르산인 기질을 포함합니다.
TRAP 염색에 필요한 산성 pH를 유지하기 위해 이 용액에 아세트산을 첨가합니다. 최적의 TRAP 효소 활성을 위해 생리학적 온도의 어두운 곳에서 세포를 배양합니다.
염색 용액은 파골세포로 들어가며, 여기서 타르타르산은 다른 세포에서 주석산염에 민감한 산 포스파타제의 가수분해 활성을 억제합니다.
동시에TRAP은 첨가된 기질을 가수분해하여 인산염기를 제거합니다. 가수분해된 기질은 염색 용액의 디아조늄염과 결합하여 적갈색의 불용성 염료 복합체를 형성합니다. 이 복합체는 효소 활성 부위에 과립으로 침전됩니다.
현미경으로 세포를 이미지화합니다. 세포질 내부에 적갈색 염료 과립이 침착되면 배양에 TRAP 함유 파골세포가 존재함을 확인할 수 있습니다.
이 단계에서 배지를 흡인하고 샘플을 1X PBS로 부드럽게 세 번 세척합니다. 다음으로, 실온에서 30초 동안 100마이크로리터의 고정 용액으로 96웰 플레이트의 각 웰에 세포를 고정합니다.
고정 후 고정액을 흡인하고 섭씨 37도로 예열된 탈이온수로 세포를 부드럽게 세 번 세척합니다. 그런 다음 탈이온수를 흡인하고 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 TRAP 염색을 추가합니다.
플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 30분 동안 넣고 빛을 차단합니다. 염색 후 TRAP 염색을 흡인하고 탈이온수로 부드럽게 세 번 세척합니다. 그런 다음 40X 배율로 도립 현미경으로 파골세포를 이미지
화합니다.