은 염색 황화 글리코사미노글리칸의 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 황화 글리코사미노글리칸의 시각화를 위한 염색 방법

황산화 글리코사미노글리칸(GAG)은 다양한 길이로 존재하는 뚜렷한 위치에서 황산화된 반복적인 이당류 단위 사슬을 갖는 길고 음전하를 띤 선형 다당류입니다.

전기영동 후 폴리아크릴아미드 겔에서 사슬 길이가 다른 관심 있는 분리된 황산화 GAG를 시각화하려면 카세트에서 겔을 조심스럽게 제거합니다. 탈이온수로 헹구고 염색을 방해할 수 있는 부착된 젤 조각을 제거합니다.

산성 알시안 블루 용액으로 처리하십시오. 산성 조건에서 중앙에 구리 원자가 있는 다가 양이온 염료인 알시안 블루는 이온 상호 작용을 통해 음전하를 띤 황산화 GAG와 특이하게 상호 작용하여 짙은 파란색 수불용성 복합체를 형성합니다.

탈이온수와 메탄올로 젤을 세척하여 잔여 얼룩을 제거합니다. 젤을 알칼리성 질산은 용액과 함께 배양합니다. 알칼리성 조건에서 Alcian 청색 결합 황산염 GAG는 양전하를 띤 은 이온이 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 부위를 제공합니다.

포름알데히드와 구연산을 함유한 현상 용액에서 젤을 처리합니다. 구연산은 포름알데히드의 최적 활성을 위해 국소 pH를 낮추며, 이는 황산화 GAG 단편 내에서 은 이온을 불용성 금속은으로 환원시켜 알시안 블루 신호를 증폭시킵니다.

pH를 낮추기 위해 정지 용액을 추가하여 은 이온의 감소를 방지하여 배경 염색을 최소화합니다. 이제 젤을 이미지화하십시오.

Alcian 청은 염색 황산화 GAG 단편 밴드는 짙은 갈색 또는 검은색으로 나타나 분리된 GAG 폴리머 사슬 길이의 고감도 시각화 및 결정이 가능합니다.

실행이 완료되면 카세트를 분해하고 탈이온되고 여과된 물이 채워진 크고 깨끗한 용기에 젤을 조심스럽게 추출합니다. 그런 다음 물을 버리고 젤을 알시안 블루 염색 용액에 5분 동안 염색합니다. 알시안 블루 염색을 버리고 대부분의 알시안 블루 염색 용액이 제거될 때까지 탈이온되고 여과된 물로 2-3회 빠르게 세척합니다.

을 질산은 염색 용액에 신선하고 깨끗한 용기에 담아 30분 동안 염색합니다. 그런 다음 탈이온화된 여과수에서 각각 30분 동안 2-3회 세척하여 은 염색 용액을 완전히 제거합니다. 물을 버리고 현상 용액을 첨가하십시오.

밴드의 모양에 대해 젤을 주의 깊게 관찰하십시오. 염색의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 현상에 몇 초에서 몇 분이 걸릴 수 있습니다. 원하는 밴드가 보이면 즉시 현상 용액을 버리고 정지 용액으로 젤을 잠시 세척하십시오.