헤파린 친화성 크로마토그래피 기반 바큘로바이러스 정제: 곤충 세포 상등액에서 바큘로바이러스를 분리하는 기술

0 조회수3:40 • July 8th, 2025

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이중 가닥 DNA 바이러스인 바큘로바이러스는 GP64와 같은 주요 바이러스 당단백질이 포함된 외피로 둘러싸여 있습니다.

세포 파편 및 오염 단백질을 포함하는 세포 배양 상청액에서 바큘로바이러스를 분리하려면 가교 아가로스 비드의 매트릭스가 포함된 헤파린 친화성 크로마토그래피 컬럼을 조립합니다. 이 비드는 헤파린 사슬에 음전하를 부여하는 황산염 그룹을 가진 선형 다당류인 헤파린에 결합됩니다.

중성 pH 및 최적의 이온 강도를 갖는 세척 완충액으로 컬럼을 평형을 유지하여 상청액 로딩 중 최대 바큘로바이러스 및 헤파린 상호 작용에 유리한 조건을 제공합니다. 바큘로바이러스 함유 상청액을 컬럼에 로드합니다.

바큘로바이러스 GP64의 염기성 아미노산은 느슨하게 결합하는 오염 물질과 달리 음전하를 띤 헤파린과의 비특이적 정전기 상호 작용을 촉진하고 컬럼에 단단히 결합합니다. 세척 완충액으로 컬럼을 헹구고 결합되지 않고 느슨하게 결합된 오염 단백질과 파편을 제거합니다.

세척 완충액보다 이온 강도가 높은 용출 완충액을 컬럼을 통과시킵니다. 이온 강도가 높을수록 바큘로바이러스-헤파린 정전기 상호 작용이 방해되어 컬럼에서 바큘로바이러스가 해리 및 용출됩니다.

유동에서 바큘로바이러스 함유 용출액을 수집합니다. 생리학적 염분 농도를 함유한 완충액으로 바큘로바이러스 현탁액을 즉시 희석하여 바이러스 불활성화를 방지합니다. 분리된 바큘로바이러스는 추가 분석에 사용될 수 있습니다.

입구 포트 A1의 세척 완충액 라인을 최소 500밀리리터의 세척 완충액이 들어 있는 병에 넣어 크로마토그래피 시스템을 설정합니다. A2 버퍼 입구 포트를 사용하여 용출 버퍼를 로드합니다.

여러

개의 50밀리리터 원뿔형 튜브를 분획 수집기에 삽입하여 컬럼 통과 바큘로바이러스 상청액, 세척 완충액 및 용출된 바큘로바이러스를 수집합니다. 헤파린 컬럼을 분당 7밀리리터의 선형 유속으로 7.9밀리리터 컬럼 부피의 세척 완충액 5개로 평형을 맞춥니다.

당 250밀리리터의 선형 유속으로 입구 샘플 포트의 샘플 펌프를 사용하여 2밀리리터의 바큘로바이러스 상청액을 헤파린 컬럼에 로드합니다. 그런 다음 자외선 흡광도 곡선이 기준선으로 돌아가 안정될 때까지 분당 2밀리리터의 선형 유속으로 헤파린 컬럼을 통해 10컬럼 부피의 세척 완충액을 실행합니다.

헤파린 컬럼의 바큘로바이러스 입자를 분당 4밀리리터의 선형 유속으로 5컬럼 부피의 용출 완충액으로 희석합니다. 바큘로바이러스 입자가 헤파린 컬럼에서 해리될 때 크로마토그램에서 단백질의 급격한 용출 피크를 관찰하십시오.

용출 후 용출된 바큘로바이러스 상청액을 20밀리몰 인산나트륨 완충액을 사용하여 즉시 10배 희석하여 후속 원심분리 중 삼투압 쇼크로 인한 바큘로바이러스 입자의 불활성화를 방지합니다.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026